脫氧核糖核酸分子設計在電化學生物傳感器中的應用

摘要 基于特殊DNA序列的構型變化的電化學生物傳感器是一種高靈敏、高特異性的生物分析方法。固定在電極表面的特殊DNA探針（莖環、核酸適配體、四聚體等）因為目標物質的結合而發生構型變化，從而產生可檢測的電化學信號，這種策略操作簡便而且特異性強，引起了研究者的廣泛關注。本文總結了目前基于基因構型變化的電化學生物傳感器的發展歷程。

關鍵詞 電化學傳感器；基因傳感器；核酸適配體；分子信標；評述

2010-10-18收稿；2011-03-20接受

本文系國家自然科學基金（No.20725516）、國家質檢總局科技計劃項目（No.HOORJ906）和上海市科委科研計劃項目（No.10142201700）資助

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1 引言

為了滿足對脫氧核糖核酸（DNA）序列或者蛋白的快速、便捷、高靈敏度和高選擇性檢測的需要，人們研究了各種的DNA傳感器：包括光學傳感器^［1，2］、電化學傳感器、質量傳感器^［3，4］和聲學傳感器^［5］等，其中電化學基因傳感器因為靈敏、快速、低成本和低能耗等顯著的特點受到廣泛關注。

采用電化學方法檢測DNA雜交可以通過引入一個具有電化學活性的插入劑作為信號基團，該基團特異性插入DNA雙鏈的分子，通過檢測這種插入基團的電化學氧化還原信號，可以感知DNA雜交反應的發生^［6～8］。Barton和合作者通過電化學催化將插入劑的氧化還原反應放大，大大提高了這種DNA傳感器的靈敏度，從而實現了對單堿基錯配的檢測。但是插入劑基團難免會發生非特意的吸附，從而導致較大的本底信號^［9］。為了降低DNA傳感器的本底信號，三明治夾心法DNA傳感器被研發出來并最終得以商業化^{［10，11］}。夾心法DNA傳感器需要引入兩條分別與目標DNA兩端雜交的探針，一條用于組裝在電極表面，另一條用于電化提供學活性基團，或者能夠催化電化學反應的酶，當有目標DNA存在時，通過3條DNA通過雜交形成三明治夾心結構，信號探針上的電化學活性基團或者酶提供可以被檢測的電化學信號。

盡管以往的DNA傳感器在靈敏度和特異性方面得到了較大的提高，實現了對10^－12～10^－15mol/L的目標DNA的高靈敏檢測^{［12～18］}，但是為了達到這樣的靈敏度，傳統的DNA傳感器需要采用多種插入劑^［19］和復雜的催化放大步驟，或者需要引入一個信號探針序列。而基于DNA構型變化設計的生物傳感器是一類操作簡單、無標記的生物傳感器^{［20， 21］}，該策略首先在電極表面固定一條特殊的DNA探針，目標物質的存在和結合將導致電極表面DNA探針構型發生變化，進而誘發一個可檢測的電流信號變化。這種傳感器操作簡便，與傳統生物傳感器相比，是一種快速、無標記，并且操作方便、易實現重復使用的生物傳感平臺。

2 電化學生物傳感器的基本類型

基于DNA構型變化設計的電化學生物傳感器的核心部分是一條固定于電極表面的特殊DNA探針，當DNA探針與目標分子結合之后，會發生明顯的構型改變，根據不同的檢測原理，可以將這類傳感器分成兩種：一種是基于探針構型發生變化之后，導致探針一端的電化學修飾與電極的距離發生改變，或者說與電極接觸的幾率發生改變，從而影響電流信號大小；另外一種是基于擴散控制的電化學過程對表面探針的組裝狀態的敏感性，當電極表面的DNA探針的構型發生改變，組裝層的厚度和密度發生改變，從而影響電化學擴散過程，使電流信號發生明顯改變。

第一種傳感器是在溶液相分子信標（Molecular beacon）基礎上發展起來的。分子信標檢測的核心內容是DNA雜交前后探針兩端距離發生的明顯改變。分子信標（圖1）是一種可以特異性識別核酸序列的熒光探針， 它的中間一段可以與目標DNA特異性結合，稱為環（Loop）區；它的兩邊可以相互雜交，稱為莖（Stem）區。分子信標兩端分別修飾一個熒光基團和一個淬滅基團。這種熒光探針通過與核酸靶分子進行雜交后發生構象的變化而發出熒光^{［22， 23］}。分子信標具有背景信號低、靈敏度高、特異識別性強、操作簡單、不必與未反應的探針分離即可實時檢測，可用于活體分析等優點，因此提出之后很快在生物化學分析、生物醫學研究和臨床診斷中獲得廣泛的應用。

受到溶液相分子信標的啟發，2004年，Fan等^［24］成功設計了基于DNA構型變化的固相電化學DNA傳感器（Electrochemical DNA，E-DNA）（圖2）。這種E-DNA體系由一條兩端自配對形成莖環結構的DNA探針構成，探針一端修飾有巰基，用于組裝于金電極表面，另一端修飾有具有電化學活性的標記作為信號基團，二茂鐵基團（Ferrocene）和亞甲基藍（Methylene blue）是常用的信號基團。無目標DNA存在時，電極表面的DNA探針兩端互補形成莖環結構，從而將自由端的電化學活性基團拉近到電極表面，產生有效的電子傳遞過程。當加入目標DNA之后，探針的環區和目標DNA雜交形成更為穩定的剛性雙鏈的結構，破壞原來的莖環結構，使電化學活性基團遠離電極表面，降低由于電子傳遞產生的法拉第電流，而這種電流的降低與電極表面雜交反應的數量呈正比關系。該傳感器成功實現了10 pmol/L DNA靈敏檢測。該傳感器雖然在靈敏度和信號模式（它屬于信號抑制模式）等方面還存在需要改進之處，但是這種傳感機制的提出為電化學DNA生物傳感器的發展帶來了新的思路。

近年來， 核酸適配體（Aptamer）被設計成DNA探針，大大促進了該類傳感器的發展。核酸適配體^［25］是一段DNA（脫氧核糖核酸）或者RNA（核糖核酸）序列，是利用體外篩選技術——指數富集的配體系統進化技術（Systematic evolution of ligands by exponcntial enrichment， SELEX），從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段^{［26～29］}。核酸適配體能與多種目標物質高特異性、高選擇性地結合，因此被廣泛應用于生物傳感器領域^{［30，31］}。當核酸適配體與目標物質發生特異性結合時，核酸適配體自身的構型會隨之發生變化。研究者把核酸適配體應用為探針，開發了很多基于核酸適配體的構型變化的電化學傳感器，又稱為E-AB（Electrochemical aptamer-based）傳感器，與電化學檢測方法的結合使之具備便攜化、操作簡單、成本低等特點，所以E-AB傳感器提高了核酸適配體在傳感器領域的應用。

將核酸適配體探針應用到E-DNA傳感器的設想最早是在2003年的美國科學院院刊（PNAS）論文中提出^［24］，并于2005年在Plaxco實驗室實現^［32］。該傳感器將一段能夠特異性和凝血酶結合的DNA序列（即凝血酶核酸適配體）兩端分別修飾一個巰基和一個亞甲基藍基團，利用巰基和金之間的共價結合，將凝血酶核酸適配體組裝到金電極表面。在待測樣品中無凝血酶時，核酸適配體呈松散的單鏈狀態，末端的亞甲基藍基團處于一定程度的自由狀態，有機會接觸到金電極表面，繼而發生有效的電子傳遞過程，此時可以檢測到一定的法拉第電流信號；當有目標物質凝血酶存在的時候，核酸適配體和凝血酶特異性結合，核酸適配體構型發生變化，末端修飾的MB基團和電極之間的距離發生變化，導致法拉第電流減小。利用這種信號電流的減小，可以靈敏檢測到6.4 nmol/L凝血酶，而且通過實驗證明該探針不但可以重復利用，而且可以應用于血清樣品的實際檢測。這種傳感策略有很多類似的應用，例如Radi等^［33］利用類似策略成功檢測了0.1 mmol/L K^＋；Lai等^［34］使用E-AB策略成功檢測了50 pmol/L 血小板源性生長因子（圖3）。

核酸適配體DNA探針可以經過設計分成兩段，而在靶標存在時可以使其粘合起來從而實現生物傳感^［35］。最近，Zuo等^［36］將核酸適配體DNA探針分成兩段，一段固定在電極表面，一段修飾有亞甲基藍基團。當目標分子存在時，兩段DNA分別和目標分子結合形成“夾心結構”，亞甲基藍被拉近電極表面，并產生可檢測的法拉第電流信號（圖4）。這種檢測策略很像生物分析中常用的雙抗體夾心檢測，但對于某些小分子，難以提供雙抗體需要的足夠的結合位點，而核酸適配體卻能夠識別自己特異性的目標小分子。實驗證明，分成兩段的一條核酸適配體序列可以與目標分子形成穩定夾心結構，即使在電極表面，其結合常數也與溶液中相當。Zuo的策略^［36］取得了很好的檢測效果，其信號增益最高達到1200%，這比之前的E-AB傳感器有很大的提高。

以往的E-AB傳感器使用一條探針，即使沒有目標物質的存在，信號修飾基團始終在電極表面，這可能造成本升高，而Zuo的策略^［36］在犧牲一定操作便捷性的前提下，實現了檢測效果的大幅度提高。2010年Du等^［37］通過層層重疊（Layer-by-layer）的方法，首先將二茂鐵-聚乙烯和納米金膠混合組裝于電極表面，然后在其上組裝可卡因核酸適配體片段1，繼而進行可卡因的捕獲。當體系中存在可卡因分子和核酸適配體片段2時，它們會和探針形成三聚體（圖4），并且對二茂鐵的電化學信號產生影響，通過檢測DPV（微分脈沖伏安分析）信號，實現了0.1 mmol/L可卡因的靈敏檢測。

第二類基于DNA構型設計的生物傳感器，是利用了DNA構型變化對溶液中的電化學信號分子（例如鐵氰化鉀）擴散過程的影響。很早以前，研究者就發現電極表面的DNA探針雜交前后，表面的組裝情況發生變化，可以影響電化學信號分子的擴散，宏觀上導致電流信號的改變^［38］。而最早將DNA分子構型改變引入這種傳感機理的，是DNA分子納米倉的研究。2007年， Mao等^［39］提出將具有特殊序列的DNA單鏈探針固定到電極表面，這種探針末端的i-motif結構對溶液pH值改變很敏感，當pH值改變，這種探針構型發生相應變化，利用DNA探針堆積效果，可以將電化學信號分子限制在電極表面的組裝層內部（圖5）。這種宏觀上可以觀察到的電流信號改變，證明所有的DNA探針非常迅速的對pH值改變作出響應，并且相互之間協同一致。

G四面體（G-quadruplex）也是一個很好的例子，富含鳥嘌呤（Guanine）的DNA序列在某些金屬陽離子作用下可以形成四面體結構，當組裝到電極表面，這種構型變化也可以用來控制電化學信號分子擴散。Zhang等^［40］首先在電極表面組裝富含鳥嘌呤的DNA探針（圖6），當加入K^＋，探針折疊形成四面體結構，由于構型發生明顯變化，自組裝層的厚度和密度發生變化，從而影響系統中Fe（CN）【sub】6【/sub】^4－在電極表面的擴散，通過電化學分析成功實現了K^＋的無標記檢測。此后，Zhang等^［41］采用同類方法實現了Tb^3＋的檢測。

上述第二類基于DNA構型變化的電化學生物傳感器，利用對電極表面擴散過程的影響，成功地實現了無標記檢測，具有重復利用的前景，但是需要對DNA探針的組裝狀態進行精密控制，而且該類傳感器對反應速度有較高要求，需要探針的構型變化迅速并一致，這樣才能形成可以檢測的電流信號變化。而且這類檢測策略的特異性不高，因此該方法的發展受到一定限制。

而第一類基于DNA構型變化的電化學生物傳感器，利用的是電化學標記與電極表面距離的改變，不但靈敏度更高，而且不需要添加外源試劑，可以直接用于實際樣品的檢測，符合電化學生物傳感器發展需求。該策略具有更好的普適性，因此在后來的發展中吸引了更多的科研興趣，成為基于構型變化設計的電化學生物傳感器的主要發展方向。因此本文中主要綜述了第一類傳感策略。

3 分析機理與條件優化

對于第一類基于DNA構型變化的電化學生物傳感器，檢測的核心內容是電化學標記物與電極表面的距離的改變，當距離達到足夠遠，就會破壞隧穿電流所需要的距離，從而實現對電流信號的抑制^{［24， 42］}。研究者也基于該類傳感器提出了一系列新的設計，以實現不同的傳感策略，但是DNA探針末端和電極表面距離的調控始終是該類傳感器的關鍵。研究者通過試驗探索，提出了提高檢測信噪比的不同優化方法。

首先是控制探針組裝密度。DNA探針是E-DNA傳感器的重要組成部分，它們在電極表面的狀態直接影響到目標物質的結合，因此對探針在電極表面的組裝密度（單位面積上組裝的探針的量）的控制對傳感策略的優化和機理的研究有重要意義。Ricci等^［43］對探針組裝密度做了詳盡的研究，對于E-DNA傳感器，信號抑制比例與目標DNA的存在有直接關系，研究發現信號抑制比例隨探針密度的改變呈現有規律的變化：在密度較小時，得到的信號抑制比例隨探針密度的增加而略有減小，可能這種減小是由于探針數量的增加造成對目標DNA的空間排斥，影響雜交效率；當組裝密度繼續增加，超過一個轉折點之后，信號抑制比例明顯隨探針密度增加而增大（圖7）。

經過計算，處于這個轉折點的探針密度，相當于探針之間的距離接近探針的長度（約8 nm）。顯然，當探針密度增大到超過轉折點，即探針之間的距離小于探針本身的長度，探針和目標DNA雜交形成雙鏈之后，DNA分子的堆積阻止了剛性的雙螺旋結構倒伏到電極表面，而且隨著探針密度的增加，雙鏈倒伏的幾率減小。這個結果說明，探針組裝密度低時，信號抑制不夠大的主要原因是即使發生雜交反應，但雙鏈有機會倒伏在電極表面，使電化學修飾物與電極表面接觸并發生電子傳遞，產生假陽性信號。White等^［44］研究了E-AB傳感器的條件優化。可卡因傳感器和凝血酶傳感器是兩種經典的E-AB傳感器，以這兩種傳感器為例，Plaxco等研究了探針表面組裝密度和組裝層厚度等條件對檢測效果的影響。他們發現，當探針之間的距離估算值與適配體大小相當時，檢測效果最好，這與理論預期十分吻合。

其次，優化分析方法也是得到更大信噪比的重要途徑。基于DNA構型變化設計的生物傳感器的另一個重要理論基礎是，在電極表面的DNA探針在與目標物質結合之后，其柔性或者說可彎曲性發生顯著改變。眾所周知，自由單鏈、具有二級結構的DNA鏈、與目標物質結合之后的核酸適配體、DNA雙螺旋等具有完全不同的柔性，影響了探針上的電化學修飾的自由度^［45］，從而改變電化學反應中的電子傳遞速率。White等^［46］采用SWV（方波伏安）分析方法考察了多種此類生物傳感器，利用SWV方法對電子傳遞速率的敏感性，研究了SWV掃描頻率對信噪比的影響，發現掃描頻率的改變不僅對信噪比大小有重要影響，甚至會改變傳感模式，在超過（或低于）某個極限頻率時，傳感器會從信號增益模式（Signal-on）變成信號衰減模式（Signal-off）， 或者發生相反的變化。

4 信號增益（Signal-on）模式

早期的E-DNA傳感器是信號衰減（Signal-off）模式，即雜交反應發生會導致電化學氧化還原電流的減小。從一開始研究者就注意到這種模式有不能避免的弊端：首先，這種信號減小模式的傳感器會受到假陽性的影響，例如不可避免地存在于樣品中的污染物會降解DNA探針。其次，這種模式下，目標DNA雜交所帶來的電化學信號抑制最多也只能達到本底信號的100%，所以Signal-off傳感器的靈敏度會受到限制。為了改進E-DNA檢測策略，研究者提出了新的信號增益（Signal-on）模式，即當目標物質存在時，電化學氧化還原信號會相應的增加，這種Signal-on模式的傳感器，理論上可以實現陽性信號的任意倍數的增長，而且很好地避免了假陽性的產生。

第一種實現信號增益模式的方法，就是通過DNA探針設計^［47］。最早的Signal-on模式的E-DNA是由Immoos等提出的^［48］，這種E-DNA傳感器使用的探針是用由一段PEG（聚乙二醇）連接兩段DNA片段組成，下端用于電極表面固定，上端修飾有具有電化學活性的二茂鐵基團，目標DNA不存在時，E-DNA探針是以自由松散的結構存在，探針末端的二茂鐵基團遠離金電極表面；而當目標DNA存在時，會同時和兩段DNA探針雜交配對，形成環狀結構，將探針末端的二茂鐵基團拉近到電極表面，最多可以產生600%的陽性電流信號增益。Wu等^［49］利用連接酶作用設計了一種新的信號增益模式DNA電化學傳感器，他們將莖環結構探針分成兩段，一段是固定到電極表面的捕獲探針，另一段是修飾有二茂鐵基團的信號探針，目標DNA可以和兩條探針分別雜交，形成一條有切口的DNA雙鏈，這時連接酶就可以將兩條探針連接起來，在去除目標DNA之后，探針兩端互補形成莖環結構，將二茂鐵帶到電極表面，并傳輸電子產生電流信號；如果沒有目標DNA或者在切口位置存在錯配，信號探針就將在清洗步驟被清除。該傳感器是信號增益模式，而且通過連接酶作用原理，很好地消除了本底信號，實現了單堿基錯配的檢測。Zhang等^［50］在腺苷酸適體探針序列上添加了一段EcoRI限制性內切酶識別序列，在沒有目標物質的情況下，電極表面的DNA探針自身形成莖環結構，并形成一個酶切位點，在內切酶作用下，探針被切斷，從而將末端修飾的二茂鐵基團去除；當腺苷酸和適體結合導致探針構型改變，酶切位點被破壞，通過二茂鐵的電化學反應可進行腺苷酸的靈敏檢測。Zhang等^［51］利用兩個適配體探針對同一個目標蛋白分子的同時識別，提出了親和依賴表面雜交檢測策略，成功構建了血小板源性生長因子-B（PDGF-BB）的信號增益模式電化學生物傳感器。該傳感器采用一條特殊的DNA探針，探針的3’端是一段PDGF適配體，可以和目標蛋白特異性結合；而探針5’端修飾有二茂鐵基團，用來輸出電化學信號。首先在電極表面組裝一條8個堿基長的短鏈DNA捕獲探針，捕獲探針可以和適配體探針的5’端末端互補雜交，但是由于互補片段長度太短，所以熔煉溫度低于20℃，難以穩定。但是在目標蛋白存在的情況下，兩條適配體探針可以同時和蛋白結合形成三聚體，然后再和電極表面的捕獲探針同時雜交，這樣可以達到更高的穩定性。雜交反應發生之后，二茂鐵修飾被帶到電極表面，傳遞電子而產生可檢測的電流信號（圖8）。這類傳感器的探針設計非常精巧和復雜，而探針的制備也有一定難度。

第二種實現信號增益模式的方法是取代法。取代法的引入使得Signal-on模式的E-DNA傳感器有了新的發展。在2006年， Xiao等提出了另一種Signal-on傳感器^［52］，這種傳感器在電極表面固定雙鏈DNA探針，DNA雙螺旋結構具有剛性結構，修飾于DNA探針末端的電化學活性基團遠離電極表面。即在沒有目標DNA存在的情況下，捕獲探針和信號探針分別在上端和下端互補雜交，中間存在一段錯配區域；當目標DNA存在時，目標DNA和捕獲探針的上端互補雜交，從而將信號探針修飾有亞甲基藍的一端取代下來，產生一段半游離的單鏈DNA，增加了亞甲基藍和電極表面接觸的機會，提高了電化學氧化還原電流。這種Signal-on傳感器得到最大700%的陽性電流信號增益，相應的檢測靈敏度也達到了400 fmol/L。但是采用取代法也給E-DNA傳感器帶來了不可回避的問題：這種傳感器不能重復利用，因為在信號探針和捕獲探針的互補雜交不夠穩定，試圖破壞目標DNA和捕獲探針的雜交的同時，也會破壞兩種探針之間的雜交；而且實驗證明這種傳感器在較為復雜的實際體系中的使用也受到嚴重的限制。Xiao等^［53］提出了一種新穎的基于部分取代法的E-DNA傳感器，這種傳感器的設計源于RNA“假結”（一種RNA三級結構，一個莖環結構的環區又和莖末端的多余的DNA片段互補形成第二個莖環）。當目標DNA不存在時，組裝于電極表面的探針形成“假結”結構，修飾在探針末端的亞甲基藍被固定于遠離電極表面的環區域，當發生目標DNA和環區雜交反應時，修飾有亞甲基藍的探針末端被取代下來，“假結”結構被打開，產生一段自由的探針末端，使得亞甲基藍有機會接近電極表面，發生電子傳遞反應。這種傳感器操作方便、可重復利用，而且實驗證明該策略在血清直接檢測過程中仍然有足夠的選擇性，但是這種傳感器只得到100%的陽性電流信號增益，檢測靈敏度只達到2 nmol/L。Xiao等的工作通過引入取代法，實現了信號增益的傳感模式，但是這些工作始終沒能完全脫離對探針的復雜改造，限制了該類傳感器的靈敏度和分析方法的普適性。Zuo等^［54］將取代法應用到E-AB傳感器中，提出“目標響應電化學核酸適配體開關”傳感器（TREAS， target-responsive electrochemical aptamer switch）靈敏檢測ATP （圖9），這種E-AB傳感器在多方面得到改良和提高。核酸適配體修飾有巰基和二茂鐵基團，和配對的DNA雜交之后，利用金和巰基之間的共價鍵將雙鏈組裝到電極表面，這是由于剛性雙鏈螺旋的限制，二茂鐵基團遠離金電極，破壞了電子傳遞過程；當有目標物質ATP存在時，由于ATP和核酸適配體的結合常數更大，所以ATP取代配對DNA的位置而與核酸適配體結合，DNA雙螺旋變成核酸適配體三級結構，二茂鐵基團被拉近電極表面，發生電子傳遞過程。這種傳感器是信號增益模式，而且有更加明確的開和關的定義，這種傳感器普適性得到大大的提高，因為這種傳感器適用于各種核酸適配體，而不像以前的E-AB傳感器需要根據不同的核酸適配體的構型變化重新設計傳感策略。該方法可以靈敏檢測10 nmol/L ATP，而且具有很好的特異性，在同樣濃度的GTP， UTP和CTP混合溶液中未發現明顯非特異信號。2008年， Lu等^［55］開發了類似的方法。最近， Zhou等^［56］利用三維有序大空納米金膜電極和量子點，實現了適體DNA取代法檢測ATP，并且靈敏度得到進一步提高。

第三種實現信號增益的方法是利用空間位阻效應。Liu等提出了一種新的Signal-on傳感器^［57］，這種新的策略采用酶催化的電化學氧化還原反應作為信號（圖10）。首先通過共價連接，在電極表面固定一層鏈霉親和素，具有莖環結構的探針一端修飾有生物素，利用鏈霉親和素和生物素之間的特異性結合，將探針固定到電極表面；探針另一端修飾有地高辛。當沒有目標DNA存在時，探針形成莖環結構，末端的地高辛受到松散環區DNA以及電極表面的共同的空間保護作用，而不能與溶液中的物質發生反應；當目標DNA與探針的環區雜交，莖環被破壞， 變成剛性雙螺旋結構，探針末端的地高辛可以自由與溶液中的修飾有地高辛抗體的辣根過氧化物酶結合，從而產生基于辣根過氧化物酶的催化電流。這種新的Signal-on傳感器，不但避免了復雜的DNA探針結構設計，而且實現了高靈敏度DNA檢測，檢測靈敏度達到10 fmol/L。經過實驗驗證，這種傳感器可以成功檢測PCR擴增產物，使用0.03 ng模板擴增的產物能夠被檢出。而且通過采用集成化電化學芯片，實現了多樣品同時檢測。Mao等也研究了類似的生物傳感策略，并實現了單堿基錯配檢測^［58］。 Wei等采用類似的方法實現了對白細胞間介素mRNA的0.4 fmol/L的靈敏檢測，在不需借助PCR擴增的條件下， 對內源mRNA的檢測靈敏度可以達到臨床口腔診斷的需求^［59］。

這類傳感器的核心是利用了組裝層與電極表面共同形成的空間位阻效應^［60］，探針末端接近電極表面時，相當于與本體溶液隔離，不能接近溶液中的電化學標記分子；只有當探針與目標物質結合導致構型發生變化，探針末端的親和基團才能捕獲溶液中的電化學標記分子，并產生相應的電流信號。這種方法不但巧妙實現了信號增益模式，而且在靈敏度和實用性方面都有很好的表現。通過引入適當的信號放大手段，例如納米粒子信號擴增，將會進一步提高檢測靈敏度。

5 結語

基于DNA構型變化的電化學生物傳感器，大多不需要外源試劑，設計和使用非常方便，適合于現場檢測，代表了生物傳感器發展的一個重要方向。DNA核酸適配體的篩選過程較抗體的制備更簡單方便，而DNA分子合成和純化技術的發展更方便了探針設計，這些都大大促進了DNA構型變化在電化學生物傳感領域的應用。而且這種方法具有廣泛的普適性，通過修改探針序列或者引入不同的核酸適配體，便能夠廣泛適用于從小分子到蛋白，甚至細胞^［52］等待測物質。與傳統的電化學方法不同，E-DNA生物傳感器主要依賴探針的構型變化，因此避免了由于非特異性吸附造成的本底信號，可以達到足夠高的特異性，很多E-DNA電化學生物傳感器實現了對實際樣品的檢測。E-DNA電化學生物傳感器將有可能在醫療診斷、軍事反恐和環境監測等領域得到廣泛應用。未來這一類傳感器研究可能集中在幾個方面：（1）目前很多基于核酸適配體的傳感器信噪比相對較低，根本原因是現有的適配體與目標物質的親和常數較小，因此需要通過探針篩選和反應條件優化，實現探針與目標物質更好、更特異的結合；（2）通過多種DNA探針的同時組裝和協同作用^［61］，可以實現多目標物質同時檢測，例如Xia等^［62］在電極表面同時組裝了可卡因適體探針和以gyrB基因為目標的莖環探針，利用目標物質結合導致的探針構型變化，并結合尿素的解鏈作用，成功提出了一種異或邏輯門設計；（3）研究新的探針組裝方法和信號放大方法，進一步提高檢測的靈敏度，在這方面，新型納米材料的應用已經成為研究熱點^{［63～66］}。最新的研究表明，很多納米材料在應用到電化學DNA傳感器領域時，具有特殊的優勢或表現出很好的應用前景。本研究組發現，當DNA雜交過程發生在尺度只有100 nm左右的針尖納米電極表面時，電化學檢測的本底信號大大降低，而且由于空間位阻減小，DNA雜交效率得到提高^［67］。如果將納米電極與適配體探針結合起來，必將提高檢測性能，而且有可能應用到微小環境中（例如細胞內）實時檢測；納米金［35， 68， 69］有很好的信號放大性能^{［70～73］}，已經在生物傳感器中廣泛應用［23，74～76］，如果應用于基于DNA構型變化的電化學生物傳感器，可以進一步提高檢測靈敏度；單層石墨烯^［77］和碳納米管^{［78～80］}等碳納米材料具有很好的DNA組裝性能，單層石墨烯可以應用于DNA雜交檢測以及DNA構型變化的區分^［81］，如果應用于DNA電化學傳感器，將有可能提高DNA組裝效果或研究無標記檢測方法。

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Deoxyribonucleic Acid Molecular Design for Electrochemical Biosensors

LIU Gang^1，2， WAN Ying²， ZOU Zi-Ying¹， REN Shu-Zhen¹， FAN Chun-Hai²

¹（Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology， Shanghai 2102053）

²（Laboratory of Physical Biology， Shanghai Institute of Applied Physics，Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201800）

Abstract A new electrochemical biosensors based on the DNA configuration switch was represented in this review. Special DNA probes （stem-loop or aptamers etc.） on the electrode surface dramatically change their configuration on the combination of target molecular giving birth to a detectable electrochemical signal. This strategy attracts extensive research interesting for its easier operation and less unspecific absorption， To this day， its analysis performance has been markedly developed with an expanding application. Here， we summarize the history of these sensors.

Keywords Eletrochemical biosensor

Deoxyribonucleic acid biosensor

Aptamer

Molecular beacon

Review

（Received 18 October 2010accepted 20 March 2011）