基于Hg2+誘導DNA雙鏈形成的熒光增強法檢測 Hg2+

摘 要 基于Hg2＋與胸腺嘧啶 （T） 形成“THg2＋T”結(jié)構的原理建立了一種簡單、靈敏的熒光增強法檢測Hg2＋的方法。兩條部分互補的富含T堿基的ssDNA在常溫下分別以單鏈狀態(tài)存在。當加入Hg2＋，由于THg2＋T鍵的形成，兩條ssDNA形成DNA雙螺旋結(jié)構，溶液中熒光分子溴化乙錠（EB）嵌入DNA雙螺旋結(jié)構，EB熒光強度增強。考察了DNA序列及DNA與EB濃度比等因素對檢測靈敏度的影響。在優(yōu)化的條件下，EB熒光強度和Hg2＋濃度在1.0×10－8～9.0×10－7 mol/L范圍內(nèi)呈線性關系，檢出限為3.0 nmol/L。Ca2＋， Mg2＋等常見陽離子對Hg2＋的檢測不產(chǎn)生干擾，方法具有良好的選擇性。

關鍵詞 汞； 熒光； 脫氧核糖核酸； 溴化乙錠； THg2＋T

1 引 言

汞是一種重要的環(huán)境污染物，具有致畸作用，可蓄積性毒物，有生物不可降解性[1]。汞的人為釋放及其對生態(tài)系統(tǒng)功能和人類健康的影響受到廣泛關注，因而其含量檢測在環(huán)境、食品等領域具有重要意義[2]。常用的檢測方法有原子吸收法[3]、原子熒光法[4，5]、高效液相色譜法[6]及電感耦合等離子體質(zhì)譜法[7]等。這些方法具有靈敏度高，選擇性好的特點。但是，此類方法所需儀器較為昂貴，在多數(shù)實驗室中的推廣應用受到限制。開發(fā)易于推廣的檢測方法，例如電化學法[8]、化學發(fā)光法[9]、熒光量子點法[10]等，逐漸為研究者們所重視。其中熒光法以其簡單、靈敏等優(yōu)點而廣受關注。

自從胸腺嘧啶（T）與Hg2＋ 特異性結(jié)合形成“THg2＋T”結(jié)構被發(fā)現(xiàn)以來[11，12]，利用富含T堿基的短鏈DNA實現(xiàn)Hg2＋特異性檢測的研究逐漸成為研究熱點[13，14]。此類檢測方法大都利用Hg2＋誘導富含T堿基的單鏈DNA折疊或2個富含T堿基的單鏈形成雙鏈，進而使單鏈DNA保護的納米金失去保護在鹽誘導下聚集，通過觀察納米金溶液顏色變化達到檢測Hg2＋的目的[15]。此方法甚至可直接用肉眼觀察顏色變化，是一種低成本、簡便快捷的檢測方法。但此類方法需要制備單鏈DNA保護的金納米粒子，且在檢測時需要較長的溫育時間才能引起足夠的單鏈DNA折疊成雙鏈DNA[16]。在熒光分析中，Ono等[17]利用分子信標的原理，設計了一種猝滅型的Hg2＋熒光傳感器。加入Hg2＋后，THg2＋T介導的發(fā)卡結(jié)構的形成，將相應熒光基團與猝滅基團拉近，二者之間發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，導致熒光信號的猝滅，從而實現(xiàn)Hg2＋的檢測，檢出限為40 nmol/L。Liu等[18]通過在UO22＋ 特異性DNA酶的莖部序列中引入TT錯配，設計了高靈敏的增強型汞離子熒光傳感器。Hg2＋誘導的構象改變以提高DNA酶的活性來檢測Hg2＋，其檢出限為2.4 nmol/L。為避免污染離子UO22＋的影響，該小組[19]又設計了一種利用構象改變、替代反應的一種增強型離子熒光傳感器，提高了檢測靈敏度。Chiang等[20]利用ToTo3嵌入劑，設計了一種無需對DNA進行熒光標記的Hg2＋熒光傳感器，靈敏度也能達到同等水平。在此基礎上，Ren等[21]利用共扼聚合物擴增熒光信號，將檢出限降到0.27 nmol/L。

本研究利用T與Hg2＋ 形成“THg2＋T”結(jié)構的特點，設計了兩條部分互補的富含T堿基的單鏈DNA。原理如圖1所示。在室溫下，由于存在多個TT錯配，兩條部分互補的單鏈DNA無法形成雙螺旋結(jié)構。溶液中的熒光染色劑溴化乙啶（EB）自由分散在溶液中，表現(xiàn)出弱的熒光。加入Hg2＋后，由于THg2＋T鍵的形成誘導溶液中單鏈DNA形成雙螺旋結(jié)構，EB嵌入雙鏈DNA因而熒光強度明顯增強，據(jù)此建立了一種熒光增強型檢測Hg2＋的方法。

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2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

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UV2400PC紫外可見分光光度計（日本島津公司，配DNA解旋溫度分析系統(tǒng)）；F7000 熒光儀（日本日立公司，配恒溫附件裝置）； PCR儀（東勝創(chuàng)新MIR序列）； ZYJⅡ冷原子熒光光度計（杭州大吉光電儀器公司）。

DNA（上海生工生物工程技術服務有限公司）。二甲基砷酸鈉（Sodium cacodylate，Alfa Aesar）；溴化乙啶（EB，國藥集團）；Hg（NO3）2（國藥基團）。實驗用水均為高純水（≥18.2Ω#8226;cm）。

2.2 實驗方法

單鏈DNA儲備液的配制：取適量水將DNA溶解，制成DNA儲備液。測定DNA儲備液在260 nm處的紫外吸收，計算其濃度。5 ℃保存，使用前用二甲基砷酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH 7）稀釋。

DNAEB熒光探針溶液的制備：將兩條對應的ssDNA以摩爾比1∶1混合，用甲砷酸鈉緩沖液稀釋。然后在DNA溶液中加入EB，使DNA和EB的最終濃度分別達到5和10 mmol/L。

熒光檢測：將探針溶液放入熒光儀，在激發(fā)波長520 nm，發(fā)射光譜530～750 nm范圍內(nèi)檢測。加入不同濃度Hg2＋溶液，孵育10 min，在相同條件下檢測溶液熒光強度。

 分 析 化 學第39卷

3 結(jié)果與討論

3.1 EB濃度的優(yōu)化

EB本身就具有一定的熒光，因而EB的濃度直接影響背景信號[22]。為得到最佳的信噪比，對EB的濃度進行了優(yōu)化。固定EB濃度為10 mmol/L，測定了體系溫度對EB的熒光強度的影響。結(jié)果表明，溫度對EB熒光強度沒有影響。考察了Hg2＋濃度對EB熒光強度的影響，結(jié)果表明，單獨的Hg2＋對EB熒光沒有影響。固定全匹配dsDNA濃度為5 mmol/L，考察不同濃度的EB在加入dsDNA前后的熒光強度之比。實驗表明，當EB濃度為10 mmol/L時，其熒光強度變化率最大。 因此， 本實驗中dsDNA濃度選擇為5 mmol/L，EB濃度為10 mmol/L。

3.2 DNA序列的選擇

選擇兩條部分互補且能夠形成TT錯配dsDNA的單鏈DNA，希望兩條單鏈DNA所形成的dsDNA的解旋溫度 （Tm） 略小于室溫，以便兩條單鏈DNA在室溫下處于解旋狀態(tài)。當加入Hg2＋時，由于THg2＋T鍵的形成，使兩條DNA形成雙螺旋結(jié)構，這樣EB就可以嵌入雙鏈DNA，熒光增強。雙鏈DNA中匹配堿基和TT錯配堿基的比例決定了dsDNA的解旋溫度。如果雙鏈DNA中TT錯配過少，加入Hg2＋前后可能無法引起足夠的Tm的變化，因而也無法誘導單鏈DNA形成雙鏈DNA。雙鏈DNA中TT錯配太多會消耗更多的Hg2＋，進而可能會降低分析的靈敏度（圖2）。對DNA序列進行了設計和優(yōu)化，測量了不同序列dsDNA的Tm（表1）。序列（5′CTGCTTGCTA3′/5′TAGCTTGCTG3′）表現(xiàn)出較好的Tm跨度，在加入Hg2＋前后，Tm由18.1 ℃增加到了35.4 ℃，正好跨越了室溫范圍。因此，選擇這條鏈作為后續(xù)實驗的dsDNA序列。

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3.3 熒光檢測Hg2＋

Hg2＋能特異性結(jié)合TT不匹配進而誘導dsDNA形成， 使得溶液中EB熒光信號增強。如圖3所示， 當溶液中不存在Hg2＋時，溶液也表現(xiàn)出一定的熒光，這主要來自于EB的背景熒光。隨著Hg2＋濃度的增加，溶液中形成dsDNA，EB的熒光強度增加。選擇EB的最大發(fā)射波長592 nm處的熒光強度作為定量依據(jù)，在優(yōu)化的實驗條件下， Hg2＋濃度在1.0×10－8～9.0×10－7 mol/L 范圍內(nèi)， EB熒光強度與Hg2＋的濃度呈線性關系I＝0.16 C（nmol/L） ＋ 29.6； R2＝0.997； 檢出限為3.0 nmol/L。

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分別取自來水、西安市曲江遺址公園湖水及流經(jīng)陜西省旬陽縣汞礦的河水，用0.45 mm 孔徑硝酸纖維素膜對水樣進行過濾得到透明澄清的液體。采用文獻[23]的方法對樣品進行處理，加入適量緩沖液將溶液pH值控制在7.4， 同時用檸檬酸納掩蔽樣品中可能存在的Ca2＋和Mg2＋。用標準加入法對樣品中Hg2＋含量進行測定，并用冷原子熒光法作為對照。自來水和湖水均未檢出Hg2＋。河水中Hg2＋的檢出濃度為（65±4） nmol/L，與冷原子吸收法檢測結(jié)果無明顯差異。

4 結(jié) 論

本研究基于Hg2＋特異性結(jié)合TT不匹配進而誘導富含T堿基的部分互補的單鏈DNA形成dsDNA，溴化乙錠（EB）可以嵌入形成的dsDNA導致其熒光增強的原理，建立了一種熒光增強型檢測Hg2＋的方法。在優(yōu)化的實驗條件下，Hg2＋濃度和EB熒光的增強在1.0×10－8～9.0×10－7 mol/L范圍內(nèi)呈線性關系，方法檢出限為3.0 nmol/L。檢測體系對Hg2＋表現(xiàn)出很好的選擇性，常見的陽離子不干擾測定。

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Fluorescence Detection of Hg2＋ Based on

Hg2＋Induced Formation of dsDNA

BO HongYan， HUANG ShaoFeng， ZENG WenJin， ZHANG Mi， DU QingLan， GUO QingYu， GAO Qiang*

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（Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science of Shaanxi Province， School of Chemistry and

Materials Science， Shaanxi Normal University， Xi′an 710062）



Abstract A simple and rapid fluorescence method was developed for the detection of Hg2＋ based on specific thymine THg2＋T structure and ethidium bromide （EB）. Duplex DNA with TT mismatches was employed. Melting temperature of dsDNA is lower than room temperature since there are several TT mismatch in dsDNA， and therefore keeps single strand in absence of Hg2＋ at room temperature. While in the presence of Hg2＋ ions， THg2＋T coordination chemistry leads to the formation of DNA duplexes. EB can intercalate into dsDNA， accompanying by enhancement of EB fluorescence. The concentrations of dsDNA and EB were optimized; detection can be finished with 1 min after addition of Hg2＋. Under the optimal conditions， the change of fluorescence was proportional to the concentration of Hg2＋ in the range of 1.0 × 10－8 to 9.0 × 10－7 mol/L and the detection limit was 3.0×10－9 mol/L. The interferences from selected inorganic ions were investigated and the sensor shows a good selectivity for Hg2＋， Ca2＋， Mg2＋ and other metal ions had no significant interferences. The proposed method was simple and selective. 

Keywords Mercury ion; Fluorescence; Deoxyribonucleic acid; Ethidium bromide; Thyminemercury（Ⅱ） structure

（Received 5 May 2011; accepted 13 June 2011）