大花重瓣非洲紫羅蘭植株再生過程中內源激素變化規律的研究

王海霞 ,韓 雪,紀麗麗,劉海燕

(黑龍江林業職業技術學院,黑龍江牡丹江157011)

1 引言

非洲紫羅蘭Saintpau lia ionantha,為苦苣苔科多年生草本,是世界著名小盆花之一。因花期長、較耐陰、株形矮小雅致,花小艷麗,被譽為“室內花卉皇后”,極具市場開發前景。目前非洲紫羅蘭品種組織培養技術已經取得了一定的進展[1～3],但已有的非洲紫羅蘭組織培養技術并不適用于新培育的大花、重瓣型品種,表現在培養周期長、芽誘導再生數量少、品種退化嚴重等問題上。

植株生長發育過程與植株內源和外源激素的種類、濃度配比有密切關系[4]。Fosket認為,各種愈傷組織分化時,對外源激素的要求不同,主要是受內源激素的影響[5],而目前對大花重瓣非洲紫羅蘭再生過程中內源激素的研究尚未見報道。本文研究大花重瓣非洲紫羅蘭再生過程中內源激素的變化規律,為合理添加外源激素,提高愈傷組織的分化率提供了理論依據。

2 材料與方法

2.1 選用材料

非洲紫羅蘭紫色品種取自香港紫羅蘭有限公司。以非洲紫羅蘭葉片為外植體。經75%乙醇漂洗30～60s,0.1%升汞浸泡攪拌10min,無菌水沖洗3遍。

2.2 培養基

選用MS為基本培養基,用于固化的瓊脂均為8g?L-1。培養基使用前,先將 pH 值調至6.0,然后用300m L的廣口瓶分裝,每瓶30m L,封口膜包扎,在121℃,滅菌20m in。接種后放置在恒溫培養室中培養,溫度為(25±2)℃,光照強度為1 000～2 000lx,每天光照12h。

2.3 愈傷組織的誘導

外植體消毒后,將葉片剪成1.0cm2左右的小塊,葉面向上接種于 M S+6-BA 1.0m g/L+NAA 0.5mg/L的培養基上。先進行2周的暗培養,然后再移至光下培養。

2.4 不定芽再生

愈傷組織誘導約30d后,繼代培養2次,選取色澤鮮艷、淺綠色或黃綠色、質地緊密、表面呈顆粒狀突起愈傷組織,轉移到分化培養基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L上。

2.5 取樣與激素提取

樣品每隔5d隨機取樣一次,每次稱重0.5g,置于-40℃冰箱中保存。取樣品,加2m L樣品提取液,在冰浴下研磨成勻漿,轉入10m L試管,再用2m L提取液分次將研缽沖洗干凈,一并轉入試管中,搖勻后放置在4℃冰箱中。4℃下提取 4h,5 000r/min離心10min,取上清液。上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟為80%甲醇(1m L)平衡柱→上樣→收集樣品 →移開樣品后用100%甲醇(5m L)洗柱→100%乙醚(5m L)洗柱→100%甲醇(5m L)洗柱→循環。將過柱后的樣品轉入5m L塑料離心管中,真空濃縮干燥或用氮氣吹干,除去提取液中的甲醇,用1.0m L樣品稀釋液定容。

2.6 內源激素的酶聯免疫測定

在10m L包被緩沖液中加入一定量的包被抗原,混勻,在酶標板每孔中加 100μL,37℃下溫育3h。洗板3次,甩干。分別加入脫落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)4種標準物,再加入待測樣和抗體,37℃競爭0.5h。洗板5次,甩干。然后加酶標羊抗兔抗體,37℃反應30m in。洗板5次后加底物顯色,顯色適當時加入2mo l/L硫酸終止反應。用2 000ng/m L濃度孔(即標準曲線最高濃度孔)調0,在酶聯免疫分光光度計上依次測定標準物各濃度和各樣品492nm處的OD值[6]。

2.7 統計方法

所得數據采用Excel計算機軟件進行相關性分析。

3 實驗結果與分析

3.1 大花重瓣非洲紫羅蘭愈傷組織誘導過程中生長變化情況

接種10d后,部分分化培養基上的葉片從切口處開始膨大,20d后,葉片表面出現褶皺,30d切口處產生少量黃綠色愈傷組織,40d后愈傷組織黃綠色特征明顯,并伴有綠色小芽點出現。通過對不同時期愈傷組織進行稱質量發現,35d時愈傷組織增長率急劇上升,達到峰值,后期逐漸下降。

3.2 大花重瓣非洲紫羅蘭分化過程中生長變化情況

切取誘導40d時的愈傷組織接種到分化培養基上,7d時愈傷組織表面長出黃色瘤狀突起,14d時部分愈傷組織有綠芽或綠色突起發生,20d時約80%的愈傷組織分化出芽,以后為芽的伸長生長期,30d時個別綠芽可長到2cm左右,但是大部分玻璃化。

3.3 大花重瓣非洲紫羅蘭愈傷組織誘導時期內源激素含量變化

如圖1所示,愈傷組織誘導過程中,各激素含量變化較大。其中GA在愈傷組織誘導初期含量急劇下降,中后期基本維持不變,可見大花重瓣非洲紫羅蘭發芽時GA的需求量較大,而在愈傷組織誘導過程中相對降低。ABA和ZR含量在誘導初期明顯下降,中期也一直保持很低的水平,由此推測ABA和ZR是大花重瓣非洲紫羅蘭愈傷組織誘導的負調控因子,其含量的下降有利于愈傷組織的發生。IAA含量在誘導起始階段急劇上升,后又明顯降低,說明IAA的強烈合成有利于愈傷組織的誘導,但是一旦愈傷組織發生,其需求量也隨之降低。

圖1 愈傷組織誘導時期內源激素含量變化

3.4 大花重瓣非洲紫羅蘭愈傷組織繼代過程中內源激素含量變化

如圖2所示,愈傷組織繼代過程中,ABA含量低于其它3種內源激素的水平,基本維持在愈傷組織誘導后期的水平。其中ZR在繼代5d時處于峰值,原因是剛轉移到新鮮培養基上,豐富的營養及調節劑促進了細胞分裂所致。后期ZR含量有所下降,GA含量明顯升高,與試驗中觀察到的小部分愈傷組織分化出芽有關。IAA在繼代初期含量明顯上升,說明在此階段IAA的合成有利于愈傷組織的大量形成。

圖2 繼代培養過程中內源激素含量變化

3.5 大花重瓣非洲紫羅蘭愈傷組織分化過程中內源激素含量變化

如圖3所示,愈傷組織分化過程中,ABA的含量基本保持一個較低的水平,其含量對愈傷組織的分化影響不大,IAA和ZR在愈傷組織分化初期含量均處于上升趨勢,分化10d后,其含量明顯下降,分析原因IAA和ZR是分化過程中的負調控因子。GA含量一直呈上升趨勢,尤其在分化前期和綠芽伸長期含量上升幅度較大,明顯高于繼代培養過程中的水平,說明GA對大花重瓣非洲紫羅蘭愈傷組織分化有重要作用。在此過程中添加適當濃度的外源GA能否提高大花重瓣非洲紫羅蘭愈傷組織的分化率,還有待于進一步研究。

圖3 分化過程中內源激素含量變化

4 結語

植物生長調節劑是植物組織培養器官分化的關鍵因素,調節其水平和配比已成為提高組織分化頻率的有效手段,而不定芽再生率的高低因所用植物生長調節劑的種類、濃度及組合而異[7]。結果表明：大花重瓣非洲紫羅蘭在植株再生過程中不同階段內源激素的變化規律各不相同。適當添加IAA有利于愈傷組織的形成;GA在愈傷組織繼代和分化過程中都呈現上升的趨勢,因此,可以適當提高GA的添加量;而ABA在愈傷組織誘導過程中含量下降,在繼代和分化過程中的含量基本處于一個較低的水平,是負調控因子。

[1]何家濤.非洲紫羅蘭組培技術研究[J].天津農業科學,2006,12(1)：20～ 22.

[2]曹秀敏,劉宏敏.非洲紫羅蘭的組織培養和植株再生[J].河南大學學報,2005,6(2)：61～62.

[3]黃 靖.非洲紫羅蘭組培快繁技術[J].福建農業科技,2007(5)：82～84.

[4]肖關麗,楊清輝.植物組織培養過程中內源激素研究進展[J].云南農業大學學報,2001(16)：136～138.

[5]夏時云,麥瑜玲.紅掌葉片離體培養過程中內源激素含量的變化[J].華北農學報,2006,21(3)：16～ 18.

[6]唐尚格,夏玉先.間接酶聯免疫法測定植物內源激素[J].西南農業大學學報,1991,13(2)：183～186.

[7]李 慧,陳曉陽.銀白楊葉片不定芽再生影響因素的研究[J].北京林業大學學報,2004,26(3)：46～50.