參力加顆粒劑對心力衰竭大鼠心肌MMP－9表達的影響

隋博文姜德友解 穎陳 飛

1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江 哈爾濱 150040

心力衰竭 (Heart Fai1ure)是由多種病因引起的心肌收縮功能和/或舒張功能障礙的病理綜合癥，其復雜的病理生理機制尚未徹底闡明。參力加顆粒是課題組治療心力衰竭的經驗方，臨床應用多年，療效確切、可靠。前期實驗證明其有良好的擴張血管、降壓利尿、增加心肌收縮力、減輕心室重構、改善心功能等藥理作用。蛋白芯片能夠在一次實驗中平行高通量地比較幾十或幾百種細胞中重要功能蛋白質的表達變化。能夠從多通路、細胞分子和整體水平揭示疾病的發生發展與治療機制。本實驗擬通過蛋白抗體芯片技術篩查參力加顆粒對心力衰竭大鼠心臟功能蛋白的表達，以期從細胞分子和整體水平揭示參力加顆粒對心力衰竭大鼠心臟的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康Wister大鼠70只，雄性，體重250±5g。飼養環境:室溫20～22℃，自由飲水，飼固體顆粒。大鼠及飼料均由黑龍江中醫藥大學驗動物中心提供。

1.2 主要藥品及試劑

阿霉素:深圳萬樂藥業有限公司。

參力加顆粒:(人參、紅景天、葶藶子、五加皮等藥物組成)由黑龍江中醫藥大學中藥制劑室提供。

蛋白芯片實驗研究在上海康成生物工程有限公司完成，相關藥品及儀器均由該公司提供。

1.3 分組與造模

雄性Wister大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表將70只大鼠隨機編號并分為空白對照組 (20只)、模型組(25只)、中藥組 (25只)。按李玉玲等［1］的方法并加以改進，將注射用的鹽酸阿霉素用注射用水配制成2mg/mL溶液，按4mg/kg，即2mL/kg劑量給予模型組;中藥組大鼠腹腔注射，每周1次，共4周，累積總量16mg/kg;空白對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 給藥方法

末次注射一周后給予藥物干預，空白對照組及模型組予生理鹽水2mL灌胃，中藥組給予中藥灌胃治療。給藥劑量按人與動物體質量 －劑量換算公式［2］:大鼠的劑量(mg/kg)=W×人的劑量 (mg/kg)，W是換算系數在這里約等于6.5，制備藥液濃度為0.185g/m1，每天2次給藥，每次2m1，共計給藥四周。

1.5 標本采集及病理

末次灌胃禁食12小時后，每組取存活大鼠8只，用20%烏拉坦 (1g/kg)腹腔注射麻醉，將麻醉大鼠固定于實驗臺，沿正中線切開胸壁暴露心臟，迅速用無菌手術剪刀摘取心臟，置入裝有4℃冰鹽水的培養皿中沖洗，沖洗后在冰塊上剝離、剪取左室心肌，取心尖部組織置于4%多聚甲醛中固定，常規脫水，石蠟包埋，切成10μm厚的切片，脫蠟，HE染色，鏡下觀察組織形態學。部分置于液氮中保存送上海康成生物工程有限公司完成蛋白芯片實驗。

1.6 樣品蛋白質抽提、定量和芯片分析

在干冰冰面上，分別切取各組大鼠適量 (250～500mg)心肌組織，加1m1含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑，勻漿后 (按KCTMBCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作)，測定樣品濃度。將所得符合標準的蛋白質提取液吸取適量 (50～500ug)加到封閉好的蛋白芯片 (RayBioTM大鼠L系列抗體芯片 I)反應槽中，隨后加入鏈親和素標記抗體，室溫孵育1小時。待反應完全后將芯片膜與化學發光底物反應，通過X射線膠片曝光，使檢測結果在膠片上顯示。

1.7 圖象和數據采集與分析

X－射線膠片曝光后，將膠片上的圖象用掃描儀掃描并轉換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運行ScanA1yze軟件，將灰度TIFF格式圖片的點陣轉化為數字型數據。每張芯片的原始數據經校正后，用來進行樣品間細胞因子表達的相對豐度分析。其相對豐度比＞1.5或＜0.6667為臨界值，篩分出空白對照組、模型組和中藥組三者間的差異表達蛋白。

2 結果

2.1 HE 染色

空白對照組心肌細胞紋理清晰，胞核位于中央，走形正常，胞漿著色均勻，間質無擴張充血;模型組心肌纖維明顯增粗、紊亂，細胞水腫，胞漿濃染，胞核皺縮，間質增生，可見少量炎癥細胞浸潤;中藥組大鼠心肌病變范圍減少，細胞排列較整齊，心肌細胞輕度水腫，胞核形態均一，間質無明顯增生，少量炎癥細胞浸潤。

2.2 蛋白芯片

嚴格按著相對豐度比＞1.5或＜0.6667為臨界值，篩選出差異表達蛋白。經分析，MMP－9存在差異性表達，與對照組相比，模型組表達上調，相對豐度比=0.6478;與模型組比較，治療組的表達下調，相對豐度比=0.5624;治療組與空白組相比無表達差異，相對豐度比=0.7285。

3 討論

2009 美國心臟病學會ACC/美國心臟協會AHA成人心衰指南的定義是:心力衰竭是由于心臟結構性或功能性疾病使心室充盈和射血能力受損而導致的一組復雜的臨床綜合征。在心力衰竭發生發展的過程中，由多種病因導致血液動力學異常，神經內分泌和細胞因子的表達被激活，從而介導心室重構，最終導致心力衰竭的發生和發展。

心室重構是各種病因所致心力衰竭的共同病理機制，是心臟基質成分合成或降解代謝失衡的結果。心室重構不僅表現為心肌細胞的凋亡、壞死、肥大和延長，同時還表現為心肌間質纖維膠原合成和分解代謝之間動態平衡的破壞。而細胞外基質合成與降解的平衡又取決于基質金屬蛋白酶 (MMPs)及其組織抑制因子 (TIMPs)的平衡。文獻報告，心肌組織MMPs表達增加和活化與心力衰竭患者心室重構密切相關［3］，在心室重構和心力衰竭中起著重要作用［4］。

MMPs主要分為膠原酶、明膠酶、基質溶解素及膜型MMPs(MT－MMP)。明膠酶包括明膠酶A(MMP－2)和B(MMP－9)，其中，MMP－9在心衰的發生發展中起著更為重要的作用［5］，可能成為反映心肌細胞外基質降解的標志物，從而反映左室重塑的過程［6］。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑。正常情況下TIMPs與MMPs呈1∶1的比例形成MMP－TIMP復合物阻斷MMPs與底物結合，調節MMPs的活性。具有降解細胞外基質的MMPs和抑制MMPs的內源性TIMPs的良好平衡在維持正常的心臟結構和功能中起重要作用。心力衰竭發生后，降解細胞外基質的MMPs升高，而TIMPs下降，兩者比例失調。從而降解除多糖以外的所有細胞外基質成分，還可通過基質降解時釋放強有力的基質合成分子如基質素及一些生物活性因子，包括轉化生長因子 (TGF－β1)、成纖維細胞生長因子 (FGF)等調節膠原的合成，最終破壞心臟纖維膠原網絡導致心肌纖維化－心室重構－心臟泵功能衰竭。

實驗結果表明:參力加顆粒能夠有效減輕心力衰竭大鼠的心肌病理變化。蛋白芯片分析結果顯示:MMP－9的表達與空白對照組相比，模型組的表達上調;與模型組比較，治療組的表達下調;模型組與空白組相比表達無差異。

綜上所述，參力加顆粒可能通過降低MMP－9的表達，抑制細胞外基質成分的降解，還可能通過抑制基質降解時釋放強有力的基質合成分子如基質素及一些生物活性因子，包括TGF－β1、FGF等調節膠原的合成，最終改善心臟纖維膠原網絡的破壞所導致的心肌纖維化－心室重構－心臟泵功能衰竭的病理生理過程，從而對心力衰竭大鼠的心臟起到治療作用。

［1］李玉玲，楊建業，唐俊明等.阿霉素誘導大鼠心衰模型不同方案的比較［J］.中國比較醫學雜志，2006，16(2):95－96.

［2］李儀奎.中藥藥理實驗方法學［M］.上海科學技術出版社，2006，38.

［3］Spind1e FG.Matrix meta11oproteinases:regu1ation and dysregu1ation in the fai1ing hearv［J］.Circ Res，2002，90∶520－530.

［4］Siwik DA，Chang DL，Co1ucciWS.Inter1eukin 1 beta and tumor necrosis Factor a1pha decrease co11agen synthesis and increasematrixmeta11oproteinase activity in cardiac fibrob1asts in vitro［J］.Circ Res，2000，86(12):1259 －65.

［5］牛杏果，趙玉蘭，周書春.腫瘤壞死因子－α、基質金屬蛋白酶－9與Ⅲ型前膠原氨基末端肽及新功能不全的關系［J］.臨床薈萃，2005，20(5):257－60.

［6］Ramon M，John B，Mark L，et a1.Diagnosis of heart fai1ure with preserved ejection fraction:improved accuracy with the use of markers of co11agen turnove［J］.European Journa1 of Heart Fai1ure，2009，11:191 －197.