中藥獨(dú)活中總香豆素高通量分析方法的建立

李 晉 郭新榮 張秋紅 常艷旭

天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193

獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸［Ange1ica pubescens Maxim f biserrata Shan et Yuan］的根，是一種常見的中藥，具有祛風(fēng)除濕，通痹止痛之功效，用于風(fēng)寒濕痹，腰膝疼痛，少陰伏風(fēng)頭痛，風(fēng)寒協(xié)濕頭痛［1］。現(xiàn)代研究表明，獨(dú)活含有數(shù)十種香豆素類化合物，如東莨菪內(nèi)脂、傘形花內(nèi)脂、二氫山芹醇、補(bǔ)骨脂素、二氫歐山芹醇乙酸酯，蛇床子素、異歐前胡素二氫歐山芹素等，其中蛇床子素含量最高［1］。

目前，獨(dú)活總香豆素含量測(cè)定方法主要以采用紫外分光光度法為主［2－3］，但該種方法由于每次僅能1－3個(gè)樣品，具有低通量的特點(diǎn)，不適合大量的樣品檢測(cè)。因此，本試驗(yàn)以蛇床子素為對(duì)照品，用多功能讀板機(jī)，擬建立一種高通量的獨(dú)活中總香豆素含量測(cè)定方法，為獨(dú)活藥材及飲片控制提供一種簡(jiǎn)單、快速、高通量的分析方法。

1 儀器與試藥

AX－105十萬(wàn)分之一天平;BP121S萬(wàn)分之一天平 (德國(guó)賽多利斯);SB－1000YDTD超聲清洗槽 (寧波新芝科技股份有限公司，40KHZ);微量多功能讀板機(jī) (infinite M200);96孔板 (Cos96ft－Corning 96 F1at Transparent)。

蛇床子素對(duì)照品 (成都曼斯特生物科技有限公司)，甲醇 (色譜純)，無(wú)水乙醇 (分析純)，純水，不同產(chǎn)地獨(dú)活飲片購(gòu)買于藥材各地藥材市場(chǎng)，經(jīng)作者鑒定為傘形科獨(dú)活。分別粉碎，過(guò)100目篩，密封保存，備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取減壓干燥至恒重的蛇床子素對(duì)照品2 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成400 μg/mL的蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取獨(dú)活藥材粉末0.125 g，置10 mL具塞試管中，加60%甲醇定容至10 mL，超聲40 min，稱定重量，聲提取40min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3 結(jié)果

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別精確量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各0.2 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，在波長(zhǎng)為200～400 nm范圍內(nèi)掃描，對(duì)照品溶液和供試品溶液均在315～325 nm范圍內(nèi)有明顯吸收，吸收峰在320 nm附近，故選擇320 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取一定量蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)液置10m1容量瓶中，加入甲醇稀釋得到3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 μg/m1溶液。以甲醇為空白對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0331x－0.0089(r=0.9995)。結(jié)果表明蛇床子素質(zhì)量濃度在3～60ug/m1范圍內(nèi)，呈良好的線性。

3.2.2 精密度

精密吸取8μg/m1對(duì)照品溶液200 μ1，加入到96孔板中，320nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)6次，吸光度值RSD 為0.27%。

3.2.3 重復(fù)性

取同一批藥材6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定總香豆素的含量為2.17%，RSD為1.83%，表明該方法重復(fù)性好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液0.2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，分別在1，2，6，8，12，16，24 h測(cè)定吸光度，考察樣品24 h穩(wěn)定性。經(jīng)計(jì)算，RSD=0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的獨(dú)活樣品粉末約0.05g，共6份，置10 mL具塞試管中，分別加入質(zhì)量為1086 μg的標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品溶液制備方法，制備含對(duì)照品的樣本溶液6份，測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果見表1，平均回收率為98.9%，RSD為 3.00%。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 樣品測(cè)定

精密稱取不同來(lái)源獨(dú)活飲片粉末，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液0.2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定其吸光度。利用回歸方程求出供試品溶液中折合蛇床子素的濃度 (總香豆素)，并計(jì)算獨(dú)活中總香豆素的含量，結(jié)果見表2。

4 討論

本研究以蛇床子素為對(duì)照品，利用多功能讀板機(jī)，建立了可同時(shí)測(cè)定96個(gè)獨(dú)活樣品中總香豆素高通量含量測(cè)定分析方法，并對(duì)不同產(chǎn)地的獨(dú)活飲片進(jìn)行了總香豆素的含量測(cè)定，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于中藥獨(dú)活藥材中總香豆素含量測(cè)定。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)即使相同產(chǎn)地的獨(dú)活飲片質(zhì)量存在很大差異;不同批次的獨(dú)活樣品中總香豆素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.95～3.39%，均值2.69%。該研究結(jié)果表明了所建的高通量的分析方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可用于獨(dú)活的質(zhì)量控制，為獨(dú)活質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

表2 不同產(chǎn)地獨(dú)活總香豆素含量

［1］中國(guó)藥典 (一部)［S］.2010年版，2010:246－247.

［2］常艷旭，朱子微，李晉，張秋紅，秦緒.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定獨(dú)活中七種有效成分含量及在質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用［J］.內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版)，2011，42(2):121－129.

［3］張恭孝，李聚倉(cāng)，王德才.獨(dú)活中總香豆素組分的含量測(cè)定［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(12):2647－2648.

［4］但飛君，蔡正軍，郭軍輝，潘家榮，王力.中藥白根獨(dú)活中總香豆素成分的含量測(cè)定［J］.三峽大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版)，2008，30(6):91－93.