高溫脅迫對6個高羊茅株系生理指標的影響

周中亮,包滿珠,王文恩

(華中農業大學園藝林學學院 園藝植物生物學教育部重點實驗室,湖北 武漢 430070)

高羊茅(Festucaarundinacea)是常用的冷季型草坪草，但不耐熱，超出生長最適溫度的高溫會使其植株的生理代謝發生一系列的變化，如細胞膜透性增大、一些對高溫敏感的酶活性下降、代謝失調、生長延緩、葉色退綠，甚至植株死亡等[1]。隨著全球氣溫的升高，高溫成為制約冷地型草坪草最重要的生態因子，冷地型草坪草在我國南方存在難以越夏的困難[2]。此外，國內在高羊茅引種和評價方面做的工作相對較多[2-5]，而在品種輻射誘變后，對其誘變后代的優良變異株系進行理化特征的研究方面，報道很少。

本研究以高羊茅品種‘佛浪’(F.arundinaceacv.Fine Lawn)原始株系及60Co-γ其輻射誘變后代中篩選的5個優良株系為供試材料，通過人工高溫逆境脅迫對傷害率、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸(Fpro)含量、葉綠素(Chl)含量、可溶性蛋白質(SP)含量、可溶性糖(Wss)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性7個指標進行研究分析，一方面比較6個材料的耐熱性，另一方面試圖探明高溫脅迫下高羊茅植株生理反應變化規律，對于長江中下游高溫高濕地區鑒定和選育耐熱的冷地型草坪草提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料 供試品種為高羊茅‘佛浪’，從武漢現代生態科技有限公司購進，由美國杰克琳公司生產。試驗材料為園藝植物生物學教育部重點實驗室于2005年3月在湖北省農科院輻照中心進行60Co-γ輻照處理后撒播于華中農業大學花卉教學基地試驗小區內又經自交1代篩選后，最終于2008年1月對篩選出的優良植株進行分株定植后保存下來的無性繁殖株系。6個試驗材料均采用分株繁殖，定植株行距為30 cm×30 cm，種植小區面積2 m×4 m，栽培基質為加入河砂改良的黃壤土，日常管理相同。為了便于記錄，對照編號為‘HN001’，其他優良株系編號依次為‘HN002’、‘HN003’、‘HN004’、‘HN005’和‘HN006’。

1.2試驗方法 將供試高羊茅材料種植在口徑20 cm、高22 cm的塑料花盆內，栽培基質為泥炭土∶珍珠巖=3∶1(體積比)，每盆裝等量基質(至離花盆上沿3 cm)，統一進行日常養護管理。置于華中農業大學花卉教學基地露地栽培場上，自然光照條件，白天/夜間溫度為(10～18) ℃/(-5～6) ℃，每周澆水3次，每次澆水直至水從盆底流出為止，每月施尿素和復合肥1次。生長3個月后，每個株系選生長較整齊、健壯的3盆植株移入人工氣候箱中進行高溫脅迫。第1天溫度設26 ℃/18 ℃(晝/夜，接近最適生長溫度)為對照，處理脅迫條件自第2天起為溫度40 ℃/30 ℃(晝/夜)，光照強度為3 000 lx，光照周期為10 h，暗處理14 h。分別在處理第1、2、3、4、5、6天取均勻一致、外觀大小相同、形態相似的完整葉片，測定傷害率、MDA含量、Fpro含量、Chl含量、SP含量、Wss含量及SOD活性。每處理3次重復。

1.3試驗指標與測定方法 傷害率采用電導法[6]；Chl含量的測定采用丙酮與乙醇(體積比1∶1)混合液浸提法[7]；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸顯色法[6]；Fpro含量采用酸性茚三酮顯色法[6]；SP含量的測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[6]；SOD活性的測定采用超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)；Wss含量的測定采用蒽酮比色法[6]。

1.4數據分析 試驗數據采用Excel 2010整理，SAS 9.1軟件對數據進行方差分析，并利用隸屬函數值進行對6個株系的耐熱性進行綜合評價。

1.4.1隸屬函數值

如果指標與耐熱性呈正相關，隸屬函數值為：

如果指標與耐熱性呈負相關，隸屬函數值為：

式中，Xj為第j個因子的得分值，Xmin為第j個因子得分的最小值，Xmax為第j個因子得分的最大值。

1.4.2權重 權重系數依據各指標的相對重要性(根據主成分分析中的方差貢獻結合專家意見校正)算出，本研究中各項指標權重分別為：傷害率，W1=0.211；SP，W2=0.132；Chl，W3=0.078；MDA，W4=0.207；Wss，W5=0.125；Fpro，W6=0.145；SOD活性，W7=0.102。

1.4.3綜合評價值

式中，D為材料在高溫條件下用綜合指標評價所得的耐熱性綜合評價值，Wj為第j個因子的權重。

2 結果

2.1高溫脅迫對傷害率的影響 高溫下，隨著脅迫時間的延長，6個高羊茅供試材料的傷害率值均呈增大趨勢(圖1)。第1天時各株系的傷害率分別為11.60%、8.40%、8.53%、9.45%、10.21%和11.27%；第6天時各株系傷害率已分別達到23.29%、34.28%、95.29%、98.93%、33.96%和42.62%，分別比第1天的各株系傷害率增長了1.01、3.08、10.17、9.47、2.33、2.78倍，其增幅順序為‘HN003’>‘HN004’>‘HN002’>‘HN006’>‘HN005’>‘HN001’。

2.2高溫脅迫對葉綠素含量的影響 各株系不同脅迫時間的Chl含量變化都存在著差異，整體呈先上升后下降的趨勢(圖2)。‘HN001’和‘HN002’株系Chl含量變化起伏不大，相對平緩，總體呈下降趨勢，從第1天的2.99和3.00 mg/g一直減少到第6天的2.49、2.12 mg/g，降幅分別為16.72%和29.33%，說明‘HN001’耐熱性較強?！瓾N003’株系，Chl含量從第1天到脅迫的第4天一直下降，由3.49下降到2.88 mg/g，降幅為17.48%；后來隨著熱脅迫的加劇，第5天增長到2.96 mg/g，第6天突然增長到3.61 mg/g，反而比對照增長了3.44%，說明此植株比較耐熱；‘HN004’、‘HN005’和‘HN006’株系總體呈先增長后下降趨勢，脅迫第2天‘HN004’和‘HN005’的Chl含量分別增長到3.71、3.73 mg/g，比第1天增長了18.53%和7.49%，第6天又分別下降到2.70、3.41 mg/g，從含量變化看‘HN005’比較穩定，耐熱性比‘HN004’強；‘HN006’ Chl含量一直增長到脅迫的第4天，達到3.86 mg/g，比第1天增長了25.73%，第6天時又下降到2.60 mg/g，比第1天下降了15.31%。

圖1 40 ℃不同脅迫時間下6個高羊茅株系傷害率的變化

圖2 40 ℃不同脅迫時間下6個高羊茅株系葉綠素含量的變化

2.3高溫脅迫對丙二醛含量的影響 從圖3可看出脅迫時間越長，各株系MDA含量就越高。第5天，6個株系MDA含量分別比第1天增長了3.01%、54.24%、115.95%、31.44%、28.01%和41.80%；‘HN003’增長幅度比較大，表明其抗性弱。第6天時表現得尤為突出，‘HN003’和‘HN004’的MDA含量分別達到20.50和23.40 μmol/g，分別為第1天的301.07%和297.11%，明顯高于其他4個株系的MDA含量，‘HN001’、‘HN002’、‘HN005’和‘HN006’的MDA含量值分別為12.46、12.66、13.68和10.94 μmol/g。結果表明，‘HN003’和‘HN004’的細胞膜脂被過氧化程度比較嚴重，抗性較弱；其他4個株系細胞膜脂過氧化程度較低，抗性較強。

2.4高溫脅迫對游離脯氨酸含量的影響 第1天6個株系Fpro含量分別為49.33、49.96、37.53、23.96、17.69和17.06 μg/g；而高溫處理到第6天時其含量分別為186.45、141.02、111.68、126.09、155.22和143.42 μg/g，Fpro含量變化各株系均顯著，因株系的耐熱程度不同，其增長幅度又有所差異，分別增長了2.78、1.82、1.98、4.26、7.77、7.41倍(圖4)。結果表明，‘HN005’和‘HN006’在遇到高溫環境時，其體內Fpro的含量往往會顯著增加，以更好地適應高溫環境；‘HN002’和‘HN003’則適應能力較弱；‘HN001’和‘HN004’對熱適應能力居中。

圖3 40 ℃不同脅迫時間下6個高羊茅株系丙二醛含量的變化

2.5高溫脅迫對可溶性蛋白質含量的影響 高羊茅各株系葉片中SP含量呈先上升后下降的變化趨勢(圖5)。經過高溫處理，開始一段時間葉片SP含量都呈升高趨勢，第4天時各株系都達到高峰值，分別是第1天含量的1.42、1.92、1.53、1.59、1.77和1.64倍，‘HN002’、‘HN005’和‘HN006’增長幅度較大，在此時期能迅速做出反應，提高SP含量，保持滲透勢，從而更好地適應高溫環境。4 d后SP含量又開始降低，第6天時降到最低水平，表明脅迫程度的加劇破壞了植株的調節機制，影響植物的正常生長，植株的耐熱性開始下降?！瓾N004’、‘HN005’和‘HN006’第6天時含量降幅較大，分別比第4天下降了63.21%、56.33%和61.30%，說明其受熱害的影響較大。相比第1天，第6天各株系含量分別下降了22.98%、2.89%、25.74%、41.48%、22.83%和36.39%，下降的幅度順序為‘HN004’>‘HN006’>‘HN003’>‘HN001’>‘HN005’>‘HN002。結果表明，熱脅迫對‘HN004’、‘HN006’和‘HN003’株系影響較明顯，其耐熱性較差；其他3個株系耐熱性較強。

圖4 40 ℃不同脅迫時間下6個高羊茅株系游離脯氨酸含量的變化

圖5 40 ℃不同脅迫時間下6個高羊茅株系可溶性蛋白質含量的變化

2.6高溫脅迫對超氧化物歧化酶活性的影響 各材料間的SOD活性變化存在著明顯的差異，整體都呈現先上升后下降的變化趨勢(圖6)。除‘HN005’外，各株系高峰值均出現在第2天，表明各株系對熱害都及時啟動了調節機制，但是變化幅度不同，‘HN002’和‘HN003’增幅較大，其值比對照組分別增長了1.30和1.07倍，說明其遇到逆境時做出的反應比較快，能迅速做出適應性的調節，熱適應性比較強。之后各株系的SOD活性都減弱，第6天時其活性值分別為521.11、639.72、429.72、293.61、542.50和612.50 U/g。結果表明，‘HN002’和‘HN006’活性值較大，其耐熱性最強；‘HN004’和‘HN003’活性值較小，其耐熱性較弱；‘HN005’和‘HN001’活性值居中，耐熱性中等。

2.7高溫脅迫對可溶性糖含量的影響 Wss含量變化隨著脅迫時間的延長整體呈降低趨勢，但是各株系含量有著明顯的差異(圖7)。6個株系Wss含量第1天分別為21.76、14.30、12.73、8.21、20.32和8.37 mg/g；隨著脅迫時間的延長，各株系Wss含量呈下降趨勢，到第6天時各株系含量只有6.03、5.58、2.82、2.95、3.08和3.61 mg/g。整個處理過程中，各株系的Wss含量均值依次為10.35、7.03、6.18、4.95、7.89和4.85 mg/g，此結果表明，‘HN001’和‘HN005’能更好地適應高溫脅迫，因為Wss含量較高，可以維持細胞膨壓，更好地保持細胞內的水分含量，從而保證植物正常生長；‘HN002’和‘HN003’含量次之，表明其耐熱性較差；‘HN004’和‘HN006’Wss含量最低，因不能維持正常的滲透平衡而趨向死亡。

圖6 40 ℃不同脅迫時間下6個高羊茅株系超氧化物歧化酶活性的變化

圖7 40 ℃不同脅迫時間下6個高羊茅株系可溶性糖含量的變化

2.8隸屬函數法綜合評價 供試各株系耐熱性的綜合評價值的大小反映各材料的綜合耐熱能力的大小，綜合評價值越大表明越耐熱。通過計算得出6個株系的綜合評價值大小分別為0.108、0.084、0.037、0.036、0.088、0.076。從綜合評價指標可以看出，6個株系的耐熱性強弱順序依次為‘HN001’>‘HN005’>‘HN002’>‘HN006’>‘HN003’>‘HN004’ (表1)。

表1 40 ℃下高羊茅各株系的耐熱性綜合評價

3 討論與結論

傷害率代表高羊茅葉片細胞膜的相對透性，傷害導致膜透性變化，電解質滲透量增加[8]。膜透性的大小反映質膜受傷害的程度，數值越大，質膜受傷害程度越大[9-10]。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發生膜脂過氧化作用。由于丙二醛是膜脂過氧化作用的產物之一，通常利用它作為膜脂過氧化指標表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱[4]。在植物所含的氨基酸中，以脯氨酸的滲透作用最為有強，當植物處于逆境脅迫下，脯氨酸合成酶類對脯氨酸的反饋抑制的敏感性降低，導致體內游離脯氨酸含量增加[11]。伍世平等[12]在對8種草坪禾草的抗逆性研究中，采用高溫(40～50 ℃)處理，也發現高羊茅體內游離脯氨酸的含量明顯升高。

本研究發現，隨著脅迫時間的延長，6個高羊茅供試株系的傷害率、丙二醛和游離脯氨酸含量一直呈上升趨勢，與許多研究[2-3,13-14]結果一致。傷害率和丙二醛含量在第6天時變化尤為顯著，尤其是‘HN003’和‘HN004’變化率劇增，表明其耐熱性較差。

超氧化物歧化酶是植物體內清除超氧自由基最關鍵的保護酶之一，它能夠消除細胞內由于逆境而引起的過氧化作用，其活性大小可以反映出植物對逆境的適應能力[10]。本研究中高羊茅各株系超氧化物歧化酶活性均呈先升高后下降的趨勢，其值越大，抗性越強，這與韓春梅[3]研究結果一致。第2天時‘HN005’呈下降趨勢，可能是剛開始受到高溫脅迫打亂了植株正常的生理功能，暫時的不適應導致了超氧化物歧化酶合成受阻[14]?？扇苄缘鞍踪|含量隨高溫脅迫時間的延長，呈先上升后下降的趨勢，可能是因為當細胞遭受短期高溫脅迫時熱激蛋白的表達水平會顯著增加，而且其可以防止細胞中蛋白變性[14-16]，故而使蛋白質含量呈升高趨勢；經過一段時間后含量又下降，可能是長時間的高溫脅迫，加劇了蛋白質的分解[14]。葉綠素含量隨著脅迫程度的加強，也呈現先上升后下降的趨勢，與許多研究[1,14,17]結果不一致。原因可能是短期高溫脅迫下，溫度的升高可以使草坪草的光合作用加強，因此葉綠素含量上升；但持續的高溫脅迫造成了葉綠體的變形和片層結構的破壞。Havaux[18]認為損害的原始位置是位于類囊體膜中的光合系統，從而導致葉綠素含量下降。Liu和Huang[17]發現草地早熟禾(Poapratensis)在持續高溫環境下葉綠素含量下降；韓春梅[3]也通過試驗證明隨著高溫脅迫時間的延長，葉綠素含量總體呈下降趨勢。此外，高溫脅迫下必然面臨著干旱脅迫，盡管保持一樣的濕度環境，一致的水分管理，但因各株系之間存在的差異(葉片大小、密度以及質地等)，導致其持水能力不同，葉片的干濕程度也不同，各株系等量葉片中所含的葉綠素的含量差異也會有所不同；羅少波等[19]認為，高溫處理后葉綠素含量變化沒有一定的規律性，不能作為大白菜(Brassicacampestris)耐熱性鑒定的指標。

本研究中可溶糖含量隨脅迫時間的延長，總體呈遞減趨勢，其變化趨勢與其他研究[7,20]結果不一致，可能原因是40 ℃是葉綠素形成的最高溫度，而且影響了酶的活性，因此高溫脅迫會大大降低葉綠素的合成速率[16]，進而減弱植物的光合作用，減少碳水化合物的合成，而且植物維持生長必然也會消耗碳水化合物和能量，更加劇了碳水化合物的減少；尤其隨著脅迫時間的延長，可溶性糖的合成速率和分解速率進一步受到影響，致使其含量變化呈降低趨勢。研究[2,17]證明，含糖量高的株系，表現出較強的耐熱性，可能是由于糖含量高，可以增強細胞持水力，提高其滲透調節作用，保證植株的正常生長。

植物的耐熱性是一個受多因素影響、復雜的數量性狀，且不同植物的耐熱機制也不盡相同，使得不同種類植物對某一具體指標的耐熱性反應也不一定相同。因此，用單一指標難以全面、準確地反映植物耐熱性的強弱，必須用多個指標進行綜合評價[21-22]。鄭文俊[14]也認為，單一的指標有時無法準確地反映植株的實際耐熱能力，結合隸屬函數法，可得到各品種耐熱性的綜合評價值，從而能比較科學地對植物的耐熱性進行評價。本研究通過對7個生理指標的綜合評價，得出高羊茅‘佛浪’原始株系和其5個優良變異株系的耐熱性強弱順序為‘HN001’>‘HN005’>‘HN002’>‘HN006’>‘HN003’>‘HN004’。

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