苜蓿假盤菌的生物學特性研究

鐘少林，王華榮，史 娟，2，3

(1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學草業科學研究所，寧夏 銀川 750021;3.西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

苜蓿褐斑病是世界苜蓿(Medicagosativa)生產中危害最嚴重的病害之一，也是中國苜蓿生產中的主要病害。寧夏平均每年因該病害造成的產量損失為40%～60%[1]。苜蓿褐斑病病原菌可以危害所有的栽培苜蓿，還可侵染白花草木樨(Melilotusalbua)、紅豆草(Onobrychisviciaefolia)、藍胡盧巴(Trigonellacoerulea)、山野豌豆(Viciaamoena)以及紅三葉草(Trifoliumrepens)等豆科牧草植物，大田侵染后常造成苜蓿植株1/3～2/3葉片枯死脫落[2]，降低干草和種子的品質，而且感染褐斑病的苜蓿因香豆雌酚等類黃酮物質的大量增加，引起采食家畜流產、不育等疾病[3]。袁慶華等[4]對來自北京、新疆、內蒙古、甘肅、山西等苜蓿假盤菌菌株進行了培養性狀的研究，發現不同地理來源的苜蓿假盤菌菌株培養性狀存在顯著差異，且存在致病性分化現象，但有關苜蓿假盤菌寧夏菌株生物學特性的報道甚少[5-6]，因此研究寧夏菌株生物學特性對于了解不同生態區域條件下病原菌的生長繁殖規律以及對指導苜蓿病害田間的綜合治理具有重要意義[7-8]。

1 材料與方法

1.1材料 供試菌種為苜蓿假盤菌(Pseudopezizamedicaginis)，由寧夏大學草業科學研究所提供，于2005年9月采用子囊孢子單孢分離法和常規組織塊分離法分離，從寧夏固原原州區種植的阿爾岡金苜蓿病葉上分離得到，用20%V8汁碳酸鈣瓊脂培養基[V8汁液200 mL(V8汁為美國進口)、碳酸鈣 2 g、瓊脂17 g、蒸餾水800 mL。培養基配制好后用1 mol/L鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉調pH值為6.0]培養。

1.2孢子懸浮液的制備 選取生長30 d左右成熟好的菌落，置于滅菌的小燒杯中，加入滅菌水2 mL，用滅菌的鑷子充分將菌落搗碎，顯微鏡下觀察有大量子囊和子囊孢子的即為子囊孢子懸浮液(孢子濃度為3.0×105～1.5×106個/mL)。

1.3溫度對苜蓿假盤菌生長的影響 選用的基礎培養基為20%V8汁碳酸鈣瓊脂培養基。分別吸取15 mL的孢子懸浮液，接種于培養基上，分別置于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃黑暗培養30 d，統計菌落數并測量菌落直徑，每個處理5個重復，試驗重復2次。

1.4水分對苜蓿假盤菌子囊孢子釋放和萌發的影響 將培養基上成熟的菌落分別移入皿蓋上有游離水和無游離水的培養基上，每皿移入5個菌落，均勻放置，10 d后肉眼觀察菌落釋放孢子情況。

葉片表面游離水保持0、2、4、6、8、10 h共6個梯度，利用離體葉，采用逆向產孢培養法，對接種后12 h的葉片進行透明和染色，光學顯微鏡下觀察孢子萌發情況，每個處理觀察50個孢子，計算孢子萌發率。

1.5pH值對苜蓿假盤菌的生長和孢子萌發的影響

1.5.1pH值對苜蓿假盤菌生長的影響 選用的基礎培養基為20%V8汁碳酸鈣瓊脂培養基。用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉將培養基的pH值分別調為2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0，共11個梯度。培養條件為20 ℃暗培養，培養30 d后統計菌落數、測量菌落直徑，并顯微觀察菌落產盤情況，每一處理至少鏡檢100個菌落。

1.5.2pH值對苜蓿假盤菌孢子萌發的影響 吸取孢子懸浮液1.5 mL加入離心管，離心(1 000～5 000 r/min，10 min)，棄去上清液，取沉淀物少許，分別加入到滴有pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0和10.0培養基的凹玻片上，置于20 ℃黑暗條件下培養，4 h后鏡檢子囊孢子萌發，計算孢子萌發率，每次至少鏡檢同一處理下的100個孢子的萌發情況，孢子萌發統計標準：芽管長度達孢子長度的1/2以上即視為萌發。

1.6光照對苜蓿假盤菌生長的影響 以pH值為6.5的20%V8汁碳酸鈣瓊脂培養基為接種用培養基，平板上接種15 mL孢子懸浮液，置于20 ℃下光周期分別為12 h光照+12 h黑暗、24 h光照、24 h黑暗環境下培養，30 d后測量其菌落直徑，顯微觀察菌落產盤情況，每一處理至少鏡檢100個菌落。

1.7苜蓿假盤菌對碳源的利用 以PA[馬鈴薯(Solanumtuberosum)、瓊脂]培養基為基礎培養基，稱取1.5 g葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘油5種碳源分別加入100 mL PA培養基中，制成含有不同碳源的固體培養基。培養條件同1.3。

1.8苜蓿假盤菌對氮源的利用 以PA培養基為基礎培養基，稱取0.1 g硝酸鈉、硝酸銨、尿素、硫酸銨、草酸銨、L-苯丙氨酸、氨基乙酸、牛肉膏、酵母提取物和蛋白胨10種氮源分別加入基礎培養基中，制成含有不同氮源的固體和液體培養基100 mL。固體培養基培養條件同1.3，液體培養基置于20 ℃、黑暗、振蕩條件下培養30 d后稱量。

1.9苜蓿假盤菌對無機鹽的利用 以PDA(馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂)為基礎培養基，稱取0.1 g FeSO4、KCl、KH2PO4、MgSO44種無機鹽分別加入100 mL PDA培養基中，制成含有不同無機鹽的液體培養基，培養條件同1.8。

2 結果

2.1溫度對苜蓿假盤菌生長的影響 該菌在5～35 ℃范圍內均能生長，低于5 ℃和高于35 ℃時不生長，5 ℃時生長緩慢，生長20 d后肉眼觀察培養基上出現針尖狀菌落。最適溫度20～25 ℃，生長15 d的菌落直徑為1.54 mm(圖1)。

圖1 生長30 d后不同溫度下苜蓿假盤菌菌落生長情況

2.2水分對苜蓿假盤菌子囊孢子釋放、萌發的影響

2.2.1水分對苜蓿假盤菌子囊孢子釋放的影響 研究結果表明，在有游離水的培養皿內，從原來的培養基中挑出的菌落能夠釋放出大量的子囊孢子，且自然彈射出的子囊孢子降落在菌落周圍的培養基上，并進一步發育為子代菌落(圖2a)，子代菌落較小，顯微觀察(圖2b)98%以上的子代菌落都能發育成完整的子囊盤形成子囊和子囊孢子。無游離水的培養皿內部分菌落彈射出孢子，沒有移出的原培養基上培養的菌落幾乎沒有孢子釋放，僅有極個別的菌落有孢子彈射的現象，表明水分是制約子囊盤孢子釋放量大小的重要因素。

2.2.2水分對苜蓿假盤菌子囊孢子萌發的影響 葉片表面的游離水及游離水保持的時間直接影響孢子的萌發。在無游離水的條件下，孢子基本不萌發(圖3)。游離水維持4 h，孢子萌發率達75%，維持6 h，孢子萌發率達95%以上，隨濕度保持時間的增加，孢子萌發率逐漸增加。孢子萌發產生的芽管及其結構如圖4所示。

圖2 菌落的彈射現象及擴繁后的子代菌落

圖3 水分對苜蓿假盤菌子囊孢子萌發的影響

圖4 萌發的芽管及其頂端產生的分支

2.3pH值對苜蓿假盤菌生長和子囊孢子萌發的影響

2.3.1pH值對苜蓿假盤菌生長的影響 該菌在pH值4.0～10.0都能生長，以5.0～8.0生長較好。不論是菌落數還是形成子囊盤，均以pH值6.0和6.5為最佳，其子囊成熟率達90%，菌落數為100個左右，表明該菌pH值的生長范圍較寬，從產生子囊盤看，pH值4.0和pH值10.0下幾乎不形成子囊盤，以pH值6.0～6.5為產盤率最高(表1)。試驗表明，該菌進行有性生殖所需要的pH值較窄。pH值1.0、2.0、3.0培養基未凝固，故未進行接種。分析顯示，不同pH值對苜蓿假盤菌子囊盤成熟率的影響尤為明顯。

表1 不同pH值對苜蓿假盤菌菌落生長的影響

2.3.2pH值對苜蓿假盤菌子囊孢子萌發的影響 子囊孢子在pH值2.0～10.0范圍內均能生長，最適pH值5.0～6.5，pH值6.0時萌發率最高達64%，pH值低于5.0或高于6.5，萌發率呈下降趨勢(圖5)。表明弱酸條件下有利于病菌子囊孢子的萌發。

2.4光照對苜蓿假盤菌生長的影響 不同光照條件對病菌的生長影響較大，表現在隨光照強度的增加，菌落生長呈明顯的下降趨勢。以黑暗下生長最好，全光照條件下生長最差。病菌在全光照條件下，菌落數極少，僅為5個，顯微觀察菌絲形態，可見菌絲中有球形膨大體，雖有子囊盤結構，但未觀察到分化的子囊；半光照條件下，菌落數為65個，菌落直徑為0.8 mm，顯微觀察，菌絲中有完整的子囊盤和分化出的子囊，但子囊孢子分化不明顯；黑暗條件下菌落數和菌落直徑的生長均明顯優于有光照的條件，顯微觀察，子囊盤發達，著生在盤上的子囊排列整齊，子囊內可見明顯的子囊孢子(表2)。表明光照既不利于病菌生長，也不利于病菌的有性生殖。

圖5 不同pH值對苜蓿假盤菌子囊孢子萌發的影響

表2 不同光照對苜蓿假盤菌生長的影響

2.5碳源對苜蓿假盤菌生長的影響 該菌能利用固體培養基上不同的碳源，但利用能力上有顯著差別。病菌對葡萄糖和麥芽糖的利用較好，形成的菌落量大。葡萄糖下只形成黑色菌落，且產盤率達86%；麥芽糖中形成黑色和土黃色2種顏色的菌落，其中黑色菌落產盤率為81%，土黃色菌落不形成子囊盤；蔗糖形成土黃色菌落，不形成子囊盤；甘油形成黑色和土黃色2種顏色的菌落，其中黑色菌落產盤率為28%，土黃色菌落不產盤(表3)。不同碳源條件下，菌落顏色不同。乳糖培養基上不形成子囊盤。表明葡萄糖和麥芽糖不僅有利于病菌的生長，且有利于病菌進行有性生殖，乳糖抑制有性生殖。

表3 不同碳源對苜蓿假盤菌菌落生長的影響

2.6氮源對苜蓿假盤菌生長的影響 在固體培養基上，10種供試氮源中，除尿素外，該菌均能不同程度利用無機氮源和有機氮源。菌落直徑和生長速率基本一致，差異不顯著，菌落數差別較大，無機氮源優于有機氮源，表明該菌對無機氮源的利用能力強于有機氮源(表4)。在液體培養基中，病菌除不能利用氨基乙酸和尿素外，對其余8種氮源均能利用。有機氮源優于無機氮源，表明液體培養條件下，病菌對有機氮源的利用能力強于無機氮源。無論是固體培養還是液體培養，尿素均抑制病菌的生長。

表4 不同氮源對苜蓿假盤菌生長的影響

2.7無機鹽對苜蓿假盤菌生長的影響 供試的4種鹽溶液，除KH2PO4沒有菌落生長外，其余3種鹽溶液下菌落生長較好，且生長量基本一致，FeSO4生長量為42.9 g，KCl生長量為43.3 g，MgSO4生長量為43.3 g。肉眼觀察，培養液中菌落均不懸浮，互相粘連，黏著于培養瓶的底部。顯微觀察，發現這4種鹽溶液下生長的菌落均不產生子囊盤。表明無機鹽對該菌的有性生殖不是必需的。

3 討論與結論

本試驗中利用組織塊分離法亦分離出了苜蓿假盤菌菌株，與袁慶華等[4]報道有異，pH值大于6.0時，苜蓿假盤菌寧夏菌株亦產盤。分離菌株選用V8汁碳酸鈣瓊脂培養基，其上亦有粉紅菌落的產生，王薊華等[6]亦有相同報道，且擴繁時該顏色菌落只產生粉紅色的子代菌。當供試碳源為葡萄糖時，僅有黑色菌落出現，為蔗糖和乳糖時，僅有土黃色菌落出現，為麥芽糖和甘油時2種顏色均有，表明碳源對菌落的顏色影響很直接。可進一步研究顏色分化與致病力的關聯性，篩選弱毒性菌株，對其致病力分化作分子生物學上的深入研究。

苜蓿假盤菌寧夏菌株對生態條件的適應范圍較廣，在5～35 ℃，pH值4.0～10.0均能生長，但是尿素能抑制該菌的生長，鹽溶液中KH2PO4沒有菌生長，從有性生殖角度來看，4種鹽溶液下生長的菌落均不產生子囊盤，pH值亦是其進行有性生殖的主要限制因素。故該菌對有性生殖的條件是極其嚴格的，利用這些特性可為該病害的無公害防治提供思路。

苜蓿假盤菌隨光照強度的增加，生長受到抑制，說明不同緯度和季節的光照狀況對病菌的生長有影響。據報道[9]，病菌致病力在地理上存在分化現象，且該菌是一種易發生變異的真菌[4]，今后應加強寧夏菌株與寄主互作過程中病菌變異的遺傳基礎及群體遺傳結構變異機制的研究，特別是分子機制上的研究。

本研究結果表明，水分是病菌子囊孢子釋放和萌發的關鍵。病菌的這種對水分的特殊要求與寧夏南部山區苜蓿褐斑病發生和流行條件相一致，這也可以解釋寧夏南部山區苜蓿褐斑病發生和流行重于川區的原因，同時也說明為何雨后苜蓿褐斑病容易爆發和流行，明確這一規律為田間該病害流行的預警發布提供依據。

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[6]王薊華，史娟，于有志.不同培養基上苜蓿假盤菌生長狀況及形態學研究[J].農業科學研究，2007，28(1)：15-17.

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