黑麥草內生真菌對植物病原真菌生長的影響

馬敏芝，南志標

(蘭州大學草地農業科技學院 農業部草地農業生態系統學重點開放實驗室 甘肅草原生態研究所，甘肅 蘭州 730020)

病害是遏制當今草坪業發展的主要因素之一[1]。引致草坪草病害的生物包括真菌、細菌、病毒、類菌原體、類病毒和線蟲，但由真菌引起的病害占植物病害總數的80%以上[2]。黑麥草屬(Lolium)植物易感染多種病害，僅國內就有14屬24種真菌引致的21種病害[3]，如離蠕孢葉斑病(Bipolarissorokiniana)、黑斑病(Alternariaalternate)、黃斑病(Curvularialunata)、網斑病(Drechslerasp.)、褐斑病(Rhizoctoniasolani)、腐霉病(Pythiumgraminicola)以及幣斑病(Sclerotiniahomoeocarpa)等[4-5]。國外報道的其他病害有綿腐病(P.aphanidermatum)、紅線病(Leatisariafuciformis)以及灰雪腐病(Typhulaincarnata)，在歐洲和北美地區冠銹病(Pucciniacoronata)在多年生黑麥草(L.perenne)上發生嚴重[6]。目前，化學殺菌劑可有效地防治植物真菌引起的病害，與農田和其他農作物相比，草地面積大，使用殺菌劑不甚經濟且易于造成生態環境的污染[7]。因此，積極采用微生物防治手段是控制病害經濟有效的措施，國外研究發現帶有內生真菌的禾草對重要植物病害有抗性，而且內生真菌對禾草生產力的提高起著重要作用[8]。

禾草內生真菌是指生長在植株體內并完成全部或大部分生活周期，而禾草不顯示外部癥狀的一大類真菌[9]。1993年，Hoveland[10]首次報道多年生黑麥草中存在內生真菌，繼而Prestidge和Gallagher[11]發現，被內生真菌感染的多年生黑麥草植株具有抗阿根廷莖象甲(Listronotisbonariensis)的作用。此后研究表明，N.lolii內生真菌與多年生黑麥草形成的共生體可提高寄主和微生物抵御生物因素和非生物因素脅迫的生態適應性[12]。已有研究表明，黑麥草-內生真菌共生體在田間或溫室條件下具有抗病性[13-14]。體外試驗也證明從黑麥草中分離的Neotyphodium屬內生真菌具有抑制真菌的活性。White和Cole[15]發現，自黑麥草中分離的內生真菌可抑制禾谷絲核菌(R.cerealis)的生長。在PDA培養基上，黑麥草內生真菌可明顯抑制德氏霉和禾谷炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)的生長[16-17]。因此，本研究以黑麥草內生真菌及發酵液為材料，對病原菌菌落生長和孢子萌發進行生物測定，分析內生真菌對幾種常見草坪草病原菌的抑菌活性，旨在為深入理解黑麥草內生真菌-病原真菌之間的關系提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1分離內生真菌所用植物材料 黑麥草種子購于蘭州市邵明草坪種子公司，分別為引自美國的愛神特(Accent)、美達利(Medary)、頂峰(Pinnacle)和球道(Fairway)等 4個草坪草品種。保存于4 ℃冷庫，以保證種帶內生真菌的活性。

1.1.2供試植物病原真菌 細交鏈孢、小麥根腐離蠕孢、新月彎孢霉、德氏霉由蘭州大學草地農業科技學院植物病理實驗室從發病草坪草中分離所得。

1.1.3培養基 內生真菌分離培養基為抗生素培養基(ABPDA)[18]，純化及測試菌培養基為PDA培養基，發酵培養基為氨基酸鹽液體培養基(AABS)[19]。

1.2方法

1.2.1內生真菌的分離 將黑麥草種子播種于育苗盤中(30 cm×25 cm×8 cm)，溫室培養(24±1)℃，植株長有3～4個分蘗時檢測黑麥草帶內生真菌的情況，并建立帶菌(E+)與不帶菌(E-)種群。參照李春杰的方法[18]，于ABPDA培養基上對E+植株中的內生真菌進行分離。待4周后觀察組織切口處有無白色菌絲體長出，將長出的菌落切取菌絲頂端，純化后移至PDA斜面保存。經鑒定各菌株屬于Neotyphodium屬的內生真菌[20]，分別編號為N-A1、N-M2、N-P2和N-F1。

1.2.2離體平板對峙測定 采用離體平板對峙法[21]，在無菌條件下，將已于PDA培養基上培養好的供試病原菌用直徑為6 mm的打孔器打孔并等距地轉入生長1周的內生真菌的PDA培養基周圍，每皿轉入3個病原菌菌餅，于(22.5±1)℃培養箱內培養4周，每處理3個重復。以同樣的病原菌菌餅等距地轉入無內生真菌的PDA培養基中作為對照，在相同條件下培養。用毫米刻度尺測量病原菌菌落與內生真菌菌落之間的距離，按下列公式計算抑菌率。

1.2.3內生真菌發酵液和病原菌孢子懸浮液的制備 發酵液制備：將4株內生真菌菌株于PDA上純培養2周，在無菌條件下用打孔器打成直徑為6 mm的菌餅接于裝有150 mL AABS培養基的250 mL三角瓶中，于(24±1)℃下，150 r/min的搖床內培養30 d后取出，10 000 r/min離心10 min，用一次性注射器吸取發酵上清液于無菌試管中，4 ℃條件下保存備用[19]。

孢子懸浮液制備：無菌條件下，在長有病原菌的培養皿中注入5 mL滅菌水，再用接種環輕輕刮下斜面上的孢子，充分分散后配成孢子懸浮液，孢子濃度大于105個/mL。

1.2.4發酵液對病原菌菌落生長和孢子萌發的測定 采用生長速率法[22]，在無菌條件下，用一次性注射器吸取發酵上清液1 mL與融化狀態下(40～50 ℃)的PDA培養基(每皿20 mL)混勻，凝固后接直徑6 mm的供試病原菌菌餅，在沒有發酵液的PDA上接病原菌作為對照，(22.5±1)℃黑暗培養，每處理3個重復。用毫米刻度尺測量病原菌菌落直徑，并計算抑菌率。

采用孢子萌發法[22]，在無菌的雙凹載玻片的凹片中，滴加1 mL各內生真菌菌株的發酵上清液，同時滴加1 mL病原菌的孢子懸浮液后混勻，孢子濃度以每視野內80～100個為宜(10×40倍鏡)。以沒有發酵上清液的相同濃度的孢子懸浮液作為對照，然后置于直徑為11 mm的培養皿中于(22～25)℃條件下保濕培養。每隔2 h檢測一次孢子萌發情況，在第10小時對照的萌發率超過85%時，用計數器對所有處理的孢子萌發情況進行統計并計算抑制率。

1.3數據處理 所有數據均用Microsoft Excel錄入并制表。 采用SPSS 15.0統計分析軟件進行差異顯著性分析，用Duncan法進行多重比較。

2 結果

2.1內生真菌對病原菌的抑制作用 離體對峙培養的結果表明，培養前期，對峙培養皿中病原菌的生長速度與對照較為一致。培養2周后，對照中的病原真菌已長滿并覆蓋整個培養皿，菌絲生長豐富，而對峙培養皿中病原菌則生長緩慢，并未產生大量菌絲。培養4周后，對峙培養皿中內生真菌繼續生長而病原菌停止向培養皿中心生長，有向培養皿邊緣擴散生長的趨勢，內生真菌與病原真菌之間產生明顯的間隔 (圖1)。

由內生真菌和病原菌之間的距離得出，不同內生真菌對同一病原菌的抑制作用不同，而不同病原菌對同一內生真菌的敏感程度表現出差異。其中N-A1菌株對小麥根腐離蠕孢和新月彎孢霉的抑制效果顯著大于對其他2種病原菌(P<0.05)，兩菌落之間的平均間隔分別達到11.30和10.67 mm；N-M2菌株對德氏霉的抑制作用顯著(P<0.05)，兩菌落之間的平均間隔為10.17 mm；N-P2菌株對小麥根腐離蠕孢的抑制作用顯著(P<0.05)，其平均間隔為 11.17 mm；N-F1菌株對細交鏈孢、新月彎孢霉和德氏霉的抑制作用顯著(P<0.05)，其平均間隔分別為10.10、10.36和11.31 mm(表1)。

圖1 內生真菌對病原菌的抑制效果

表1 離體對峙培養試驗中內生真菌與病原真菌菌落之距 mm

與對照相比，4株內生真菌不同程度地抑制了病原菌菌落的生長。N-A1和N-F1菌株對細交鏈孢的抑制效果顯著高于另外2株內生真菌(P<0.05)，抑制率分別為42.51%和44.73%；N-A1和N-P2菌株對小麥根腐離蠕孢抑制效果顯著高于另外2株內生真菌(P<0.05)，抑制率分別為46.25%和46.55%；N-A1和N-F1菌株對新月彎孢霉的抑制效果顯著高于另外2株內生真菌(P<0.05)，抑制率分別為45.52%和44.70%；N-A1、N-M2和N-F1菌株對德氏霉的抑制效果顯著高于N-P2(P<0.05)，抑制率分別為43.24%、43.97%和46.62%(表2)。

2.2內生真菌發酵產物對病原菌的影響

2.2.1對病原菌菌落生長的影響 培養1周后，在含有內生真菌發酵產物的培養皿中，病原菌菌落生長速度緩慢，菌絲向外生長明顯受到抑制，菌落邊緣向外擴散受到抑制。與對照相比，生長在含有內生真菌發酵產物培養基上的病原菌均受到不同程度的抑制作用(圖2)。其中N-F1菌株發酵產物對細交鏈孢、小麥根腐離蠕孢、新月彎孢霉和德氏霉的抑制效果顯著高于其他3株內生真菌(P<0.05)，抑制率分別為17.79%、57.20%、33.79% 和41.52%(表3)。

表2 離體對峙培養試驗中內生真菌對病原真菌菌落生長的影響

圖2 內生真菌發酵產物對病原真菌的抑制作用

表3 內生真菌發酵液對病原真菌菌落生長的影響

2.2.2對病原菌孢子萌發的影響 在10×40倍顯微鏡下觀察到，被內生真菌發酵產物處理過的病原菌孢子萌發的個數以及芽管長度明顯小于對照組中的孢子，說明內生真菌的發酵產物對孢子萌發具有一定的延遲作用。各處理孢子萌發數均呈下降趨勢，其中4株內生真菌菌株對小麥根腐離蠕孢的抑制作用較強，抑制率分別為77.70%、62.08%、55.03%和86.60%；N-F1菌株對4種病原菌的抑制效果顯著高于其他3株內生真菌(P<0.05)，抑制率分別達到79.14%、86.60%、85.58%和80.25%(表4)。

表4 內生真菌發酵液對病原真菌孢子萌發的影響

3 討論與結論

本研究以常見的草坪草病原菌為作用對象，探討了從不同品種的多年生黑麥草中分離出的Neotyphodium屬內生真菌及發酵產物的抑菌作用。結果表明，離體對峙培養條件下黑麥草內生真菌分離菌株對病原菌菌落的生長均表現出不同程度的抑制作用。不同內生真菌對同一種病原菌的體外抑制作用不同，可能是由內生真菌分泌的抑菌物質的種類和數量存在差異所致[23]，而同一株內生真菌對不同病原菌的抑制作用也表現出差異，這可能是同種內生真菌分泌多種抑菌活性物質，而不同活性物質只能抑制某一特定病原菌的生長，也可能是每種內生真菌只能分泌一種抑菌活性物質，但是不同病原菌對它的反應不一致，這有待進一步研究[24]。張苗苗等[25]對線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)內生真菌抗植物真菌活性測定中也發現，Acremonium屬的內生真菌較其他內生真菌表現出更強的抑菌活性。在培養過程中，對峙培養皿中病原菌生長緩慢，內生真菌則繼續生長，這可能是由于內生真菌具有營養競爭能力，在生長過程中逐步占據營養空間，從而使病原菌得不到足夠的營養而停止生長，因此競爭作用或許是內生真菌抑制病原菌的主要機制之一。另外，在實驗室發現離體條件下內生真菌的純培養可以產生毒素或生物堿等物質，對病原菌的生長具有抑制作用[26]，這或許是內生真菌抑制病原菌生長的另外一種作用機制。

以往研究表明，內生真菌純培養的液體提取物具有抑制多種植物病原菌生長的作用[27]。黑麥草內生真菌在馬鈴薯葡萄糖液體培養基中的提取液可抑制或延遲大刀鐮孢菌(Fusariumculmorum)的孢子萌發[26]。本研究中，黑麥草內生真菌的發酵產物對4種病原菌的菌落生長和孢子萌發表現出較好的抑制作用，這與Christensen[28]研究黑麥草內生真菌提取液抑制病原真菌生長的結果相類似。并且各內生真菌菌株對同一種病原菌的抑制效果表現出差異，產生這種差異的原因一方面可能是內生真菌-宿主共生體遺傳型表現不同所致[29]，另一方面是由于參試的病原菌屬于半知菌亞門，在特性上存在差異，因此，病原菌對內生真菌的敏感程度也表現出差異。其中N-F1菌株的發酵產物對各病原菌表現出較強的抑菌活性且顯著高于其他3株內生真菌(P<0.05)，這可能是不同菌株產生不同數量和濃度的抑菌物質所致，但具體的抑菌成分和抑菌機制有待進一步研究。黃東益等[24]對旗草(Brachiariabrizantha)內生真菌的研究發現，對病原菌有抑制作用的內生真菌提取液進行熱處理或蛋白水解酶處理后，抑菌作用明顯減弱或消失，說明抗真菌活性物質是熱不穩定的、能被蛋白酶水解，推斷這類抗真菌物質可能屬于蛋白質或酶類。這為以后探尋和明確黑麥草內生真菌發酵產物的抑菌活性成分提供了新的思路。

國內外研究者已從黃花蒿(Artemisiaannua)[30]等植物的內生真菌發酵液中提取到對病原菌有抑制作用的活性物質，說明內生真菌可能成為生物防治中有潛力的微生物農藥。目前人們發現近80屬290多種禾本科植物中含有內生真菌，我國已在14屬43個種的天然草地禾草中發現內生真菌[26]，是一個豐富的內生真菌資源庫，要充分利用這一資源，既要對禾草內生真菌共生體進行深入研究，也要開拓其可能的優勢作用。

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