小花堿茅HKT1;4基因片段的克隆與序列分析

李 劍,趙常玉,吳永娜,包愛科，馬 清,郭 強(qiáng),王鎖民,張金林

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 農(nóng)業(yè)部草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730020)

大多數(shù)農(nóng)作物不能在高鹽環(huán)境下生長，灌溉地鹽漬化對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力造成了嚴(yán)重威脅[1-2]。鹽漬化土壤中，Na+是一種毒害離子，它可以抑制K+的吸收，降低酶活性，影響植物新陳代謝，最終表現(xiàn)為植株生長緩慢甚至死亡[3-4]。K+是植物生長發(fā)育所必需的礦質(zhì)元素之一，也是植物細(xì)胞中最豐富的一價(jià)陽離子，占植物干質(zhì)量的2%～10%，它參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓、電荷平衡、氣孔開閉和酶活性等許多重要的生理生化過程[5-6]。在鹽脅迫下，限制Na+吸收，增加Na+外排，同時(shí)提高對K+的選擇性吸收能力，維持細(xì)胞中高的K+/Na+是植物抗鹽性的關(guān)鍵[7]。大量研究發(fā)現(xiàn)，高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(high-affinity K+transporter，HKT)在高等植物拒Na+和選擇性吸收K+過程中發(fā)揮著重要作用[8-9]。Schachtman和Schroeder[10]首次從小麥(Triticumaestivum)幼根中克隆到TaHKT2;1，隨后相繼在其他植物中也發(fā)現(xiàn)了HKT類蛋白。根據(jù)異源表達(dá)差異，Platten等[11]將HKT類蛋白分為兩類：第1類以擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtHKT1;1為代表，主要轉(zhuǎn)運(yùn)Na+，在Na+回收中發(fā)揮作用，包括水稻(Oryzasativa)OsHKT1;5、一粒小麥(T.monococcum)TmHKT1;4-A2、TmHKT1;5-A1和小麥TaHKT1;5-D1；第2類以小麥TaHKT2;1為代表，為K+和Na+的共轉(zhuǎn)運(yùn)體，在K+、Na+選擇性吸收中發(fā)揮重要作用，包括水稻OsHKT2;1和OsHKT2;2等。

小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)廣泛分布于我國東北和西北地區(qū)，是禾本科堿茅屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，耐鹽堿[12-13]。近年來，小花堿茅極強(qiáng)的抗鹽堿性引起人們的廣泛關(guān)注。閻秀峰等[14]通過洗葉技術(shù)，認(rèn)為小花堿茅的耐鹽機(jī)制是其具有泌鹽能力。韋存虛等[15]采用掃描電鏡和X射線電子探針研究發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)層泌鹽可能是其正常功能。但解剖學(xué)和葉表面觀察都沒有發(fā)現(xiàn)鹽腺或泌鹽結(jié)構(gòu)[16-18]。研究表明，小花堿茅根部對K+/Na+選擇吸收能力很強(qiáng)，約是小麥的2倍[19]；最新研究表明，葉片泌鹽并不是小花堿茅耐鹽的主要機(jī)制；限制Na+單向內(nèi)流速率，減少體內(nèi)Na+凈積累，維持高的K+/Na+則是小花堿茅抗鹽的關(guān)鍵[20]。本研究在已經(jīng)克隆小花堿茅Actin[12]和AKT1[13]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步克隆其HKT1;4基因片段，旨為進(jìn)一步探明小花堿茅拒Na+的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 小花堿茅種子2010年采自甘肅省張掖市臨澤縣白寨村。EscherichiacoliDH5a菌株由農(nóng)業(yè)部草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑 植物總RNA提取試劑盒(生工生物工程上海有限公司生產(chǎn))，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司生產(chǎn))，PCR擴(kuò)增試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、pMD19-T Simple載體(寶生物工程大連有限公司生產(chǎn))，DNA ladder(天根生化科技北京有限公司生產(chǎn))，其他生化試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1總RNA的提取 從小花堿茅幼根(K+饑餓處理24 h)中提取總RNA，方法參考總RNA提取試劑盒說明書。

1.3.2引物的設(shè)計(jì)與合成 通過對高粱(Sorghumbicolor)、水稻和一粒小麥等幾種植物HKT1;4基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，找出高度保守的片段，對應(yīng)于核苷酸片段，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用DNAMAN和Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)一對簡并引物PF和PR，推測目的片段長度為635 bp。引物由上海生工合成。PF：5′-TCGYCTACTTCSTCRCCRTCTCCT-3′，PR：5′-CATGWACCCGCAGYTSGAGAACGT-3′，其中，Y=C/T，S=C/G，R=A/G，W=A/T。

1.3.3RT-PCR擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄過程按照試劑盒操作說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL、10 μmol/L PF 1 μL、PR 1 μL，Taq DNA polymerase(5 U/μL) 0.5 μL，cDNA 2 μL，加無菌水至總體積50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃熱啟動2 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，按照膠回收試劑盒說明書回收和純化目的片段，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4陽性克隆的篩選與鑒定 將回收目的片段與pMD19-T Simple載體按照物質(zhì)的量10∶1混合，于16 ℃連接2 h。連接產(chǎn)物全部加入到100 μL感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，冰浴30 min；42 ℃熱激90 s；冰浴1 min。加入800 μL無氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基，搖菌1 h(37 ℃，180 r/min)。將菌液加入含有氨芐、x-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，挑選白色單菌落，經(jīng)PCR檢測后送生工生物工程上海有限公司測序。

1.3.5序列的生物信息學(xué)分析 BLAST在NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進(jìn)行；序列的翻譯和分析比較通過DNAMAN和Primer Premier 5.0生物軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1總RNA的提取與檢測 以小花堿茅幼根為材料提取總RNA，甲醛變性膠電泳和NANODROP1000核酸蛋白檢測儀檢測表明，提取的總RNA完全滿足下一步試驗(yàn)需要。

2.2RT-PCR擴(kuò)增 以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用簡并引物PF和PR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)在比600 bp略高處有一條帶，且上下無雜帶，與預(yù)測的目的片段大小基本一致(圖1)，推測可能是HKT1;4基因片段，有待進(jìn)一步檢測。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3陽性克隆的鑒定 將目的片段連接到pMD19-T Simple載體上，轉(zhuǎn)化E.coliDH5a。從LB培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑選5個(gè)白色單菌落，分別搖菌后提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測，得到的擴(kuò)增片段大小與所克隆片段一致(圖2)，表明這些為陽性克隆，可以進(jìn)行測序。

圖2 陽性克隆的PCR檢測

2.4測序結(jié)果與序列分析 陽性克隆測序結(jié)果表明，本試驗(yàn)得到一段長629 bp的HKT1;4序列片段，與GenBank中注冊的高等植物HKT1;4基因核苷酸序列同源性在74%以上；編碼209個(gè)氨基酸(圖3)，將此氨基酸片段與其他植物HKT1;4蛋白氨基酸進(jìn)行同源性比對后發(fā)現(xiàn)，與一粒小麥TmHKT1;4-A2、TmHKT1;4-A1、高粱(Sorghumvulgare)SbHKT1;4和水稻OsHKT1;4的同源性分別為73%、70%、67%和61%，從而確定本試驗(yàn)克隆的片段為小花堿茅HKT1;4基因，并命名為PutHKT1;4(圖4)。采用在線TMpred Server軟件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) 對小花堿茅PutHKT1;4氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)可能存在5個(gè)跨膜區(qū)，序列位置分別為1-17，32-51，61-82，154-171，193-209(圖3、圖5)。多重比對后發(fā)現(xiàn)，小花堿茅PutHKT1;4氨基酸序列上存在編碼P-loop A區(qū)域的一段保守序列IDLFFTAVSSMS，箭頭所指的S為P-loop A區(qū)域的特異性絲氨酸離子選擇性位點(diǎn)(圖6)。

圖3 小花堿茅PutHKT1;4基因片段核苷酸及推測的氨基酸序列

圖4 PutHKT1;4與其他植物HKT1;4氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 PutHKT1;4氨基酸片段的跨膜區(qū)預(yù)測

3 討論與結(jié)論

土壤中過多的Na+對植物是有害的，尤其是對鹽比較敏感的農(nóng)作物。研究Na+在植物體內(nèi)的再循環(huán)途徑，對于提高植物抗鹽性意義重大。水稻OsHKT1;5的作用是從木質(zhì)部中回收Na+，參與Na+在植物體中的再循環(huán)，從而減少Na+在植株地上部的積累[8]。 James等[21]從硬粒小麥(T.turgidum)耐鹽品系149中分離到兩個(gè)排Na+的主效基因Nax1和Nax2，擁有任意一個(gè)基因的品系植株比其他品系有更低的從根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的比率，同時(shí)增加吸收K+的比率。Nax1位點(diǎn)能夠從葉鞘和根木質(zhì)部卸載Na+，防止Na+在地上部的過多積累，而Nax2位點(diǎn)只能在根部發(fā)揮作用。后來研究表明，一粒小麥TmHKT1;4-A2可能是Nax1的候選基因，TmHKT1;5-A1可能是Nax2的候選基因[22-23]。本研究所克隆的PutHKT1;4基因和一粒小麥TmHKT1;4基因一樣，屬于HKT家族的第1類。通常第1類HKT在第1個(gè)P-loop區(qū)域都有一個(gè)絲氨酸離子選擇性位點(diǎn)，第2類為甘氨酸離子選擇性位點(diǎn)(個(gè)別除外，如水稻OsHKT2;1)，這些位點(diǎn)可能與K+、Na+選擇性吸收相關(guān)[11]，本試驗(yàn)克隆到的小花堿茅PutHKT1;4也有一段12個(gè)氨基酸的保守P-loop區(qū)域，且有絲氨酸位點(diǎn)。小花堿茅蘊(yùn)藏著豐富的抗鹽基因資源，PutHKT1;4基因片度的克隆將為進(jìn)一步研究小花堿茅耐鹽的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖6 PutHKT1;4氨基酸序列與其他植物HKT1;4氨基酸序列多重比對圖

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