蝴蝶蘭幼嫩花梗組織培養和快速繁殖

張彥妮，邊紅琳，陳立新

(1.東北林業大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江省農科院園藝分院，黑龍江 哈爾濱 150069)

蝴蝶蘭(Phalaenopsisamabilis)，又名蝶蘭，為蘭科蝴蝶蘭屬植物，其姿態優美、色澤豐富、艷麗，花期持久。在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”之美稱，是蘭科植物中栽培最廣泛的四大觀賞熱帶蘭之一，是室內綠化美化重要的觀賞花卉，國內外市場對其需求量大。但是，由于蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，很難用傳統分株方式進行無性繁殖；且蝴蝶蘭種子極小，沒有胚乳，發育不完全，極難萌發。組織培養作為生物技術育種的基礎，可以解決繁殖慢、種苗供不應求的難題[1-2]。目前，隨著生物工程技術的廣泛應用，組織培養也已成為蘭花快速繁殖的重要手段。關于蝴蝶蘭的組織培養有許多報道[3-6]，這些研究多是以蝴蝶蘭的葉片[7]、莖尖[7-8]、花梗腋芽[7-10]、種子[11]、根尖[7]、花梗節間[12]為外植體進行組織培養研究，對以花梗為外植體的研究，大多是以未開花或即將開花的花梗為外植體，這對母株傷害較大，影響其觀賞價值和經濟價值。本研究以較為幼嫩的廢棄的蝴蝶蘭花梗(為使花期一致，通常剪掉提前抽出的花梗)為外植體，在培養基上誘導休眠芽的萌發，通過萌發的幼苗的莖尖為材料進行類原球莖的誘導、增殖、分化、生根，初步建立組織培養再生體系，為蝴蝶蘭的大量繁殖探索新的有效的材料和途徑。

1 材料與方法

1.1試驗材料 供試的蝴蝶蘭幼嫩的花梗由黑龍江省農科院園藝分院觀賞溫室提供。

1.2試驗方法

1.2.1花梗的消毒 取具有休眠芽的蝴蝶蘭幼嫩花梗，將其橫切成1.5～2.0 cm(每段帶1個花芽)，用75%的酒精棉球擦去表面灰塵。然后在洗衣粉中浸泡10～15 min，期間不斷搖晃，再用自來水沖洗20～30 min；在超凈工作臺上用75%的酒精浸泡10～30 s；在0.1%升汞溶液中浸泡5～20 min；無菌水沖洗3～7次，用無菌濾紙吸干花梗表面的水分，將花梗剪成長1.0～1.5 cm的小段(每段帶1個花芽)，接種到不同培養基上；先暗培養14～21 d，然后再將其放入光照條件下培養。培養室溫度為(25±2)℃，光/暗周期為14 h/10 h，光照強度2 500～3 500 lx。

1.2.2誘導分化及增殖培養 將消毒后的花梗或無菌苗的莖尖，在無菌條件下，將其切割成適當大小后，接種于不同的誘導分化和增殖培養基上，比較其萌發、生長、分化和增殖狀況。

1.2.3組培苗的生根誘導 當獲得的組培苗長到2～3 cm時，將其轉入生根培養基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L上進行生根誘導，一個月后統計生根率、根的長度以及生根狀況等。

所有培養基均附加10%椰子汁、0.1%活性炭、20 g/L白砂糖和8 g/L瓊脂，然后用1 mol/L NaOH調節pH值為5.4～5.6。在121℃條件下高壓滅菌13 min。

1.2.4組培苗的馴化和移栽 參照張彥妮等[13]的方法進行組培苗的馴化和移栽。

1.3統計分析 為判定各種激素組合對蝴蝶蘭花梗腋芽萌發率、分化率、死亡率及腋芽組培苗莖尖分化率的影響，采用前向逐步回歸分析判斷各激素貢獻率及其顯著性、顯著因子，再用單因素方差分析各激素濃度對萌發率、分化率及死亡率的影響，采用單因素顯著性檢驗方差分析的顯著性。多元回歸分析和方差分析用Statistica 6.0完成(StatSoft, Inc.)。

2 結果與分析

2.1蝴蝶蘭花梗消毒方法和消毒時間的比較 滅菌時間對外植體的消毒效果和成活率至關重要。用0.1%升汞消毒不同時間，花梗腋芽培養2～7 d后，接種的一部分腋芽表面污染，一部分生長良好。滅菌時間短，污染率高，但長時間的消毒，對外植體的傷害較重，接種后外植體萌發時間相對較長。滅菌時間在15 min時，污染率較低，萌發時間相對較早，滅菌時間在20 min時，污染率雖然最低，但萌發時間延長(表1)。

表1 0.1%升汞不同消毒時間的處理效果

2.26-BA與NAA組合對蝴蝶蘭花梗腋芽萌發和分化的影響 在不同培養基上的蝴蝶蘭花梗腋芽萌發及生長結果表明(表2、表3)，花梗腋芽在接種3 d后，就出現萌動膨大現象(圖1A和圖1B)，有的花梗腋芽在35 d左右就長出小葉；有的在腋芽周圍突起，以后逐漸發育成幾個不定芽(圖1C)。這些不定芽芽大小不等，表明不定芽的分化不同步或生長發育不一致。

激素種類和濃度對于花梗腋芽啟動培養有一定的影響。在培養基1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發率最高，達40%。在培養基1/2 MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.5mg/L上，花梗腋芽產生的不定芽數量最多，分化率最高，但整體長勢一般。可能是由于6-BA促進不定芽的形成，但影響了植株的長勢。花梗腋芽接種后，在每種培養基上均有較高的死亡率，均是因為褐化造成的。這可能與蝴蝶蘭中含有較多的酚類物質有關。

表2 在不同1/2 MS培養基上蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發生長狀況

表3 在不同MS培養基上蝴蝶蘭花梗腋芽的誘導及生長狀況

圖1 接種的花梗腋芽膨大萌發及產生的不定芽

多元回歸分析表明，NAA、2,4-D和6-BA對蝴蝶蘭花梗腋芽萌發率的影響基本相當，都沒有達到95%的顯著水平(結果未列出)。NAA、2,4-D和6-BA對蝴蝶蘭花梗腋芽死亡率的影響中，NAA和2,4-D都顯著影響死亡率，但NAA影響更強，6-BA不顯著。分別對NAA和2,4-D與死亡率做單因素方差分析，結果表明(圖2)，NAA質量濃度為0.2 mg/L時蝴蝶蘭死亡率最高，濃度為0時死亡率最低。2,4-D兩個質量濃度的方差分析結果不顯著。NAA、2,4-D和6-BA對蝴蝶蘭花梗腋芽分化率的影響中，6-BA的影響更為主要(達到95%顯著水平)，單因素方差分析發現,隨6-BA濃度增加(圖3)，蝴蝶蘭花梗腋芽分化率增加。

在附加不同濃度激素的MS培養基上，花梗腋芽萌發率較高(表3)。在培養基MS+6-BA 2 mg/L+2,4-D 0.01 mg/L上，萌發率為54.5%，分化率為18.2%，產生的芽數較多(圖1D)。

2.3激素組合對蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖誘導的影響 將花梗腋芽組培苗的葉子剝去，切1.5～2.5 mm莖尖，將其接種在附加不同激素種類和濃度的培養基上。結果發現，有些莖尖顏色變綠，30 d后上面出現顆粒狀的亮綠色的組織，這些組織逐漸長成類原球莖(圖4)，2～3個月后，這些類原球莖有的長出小葉，有的繼續分化類原球莖(圖5)。不同的培養基對花梗腋芽組培苗莖尖的誘導效果不同(表4)。在培養基1/2 MS+6-BA 6 mg/L+NAA 0.2 mg/L和1/2 MS+6-BA 5 mg/L+2,4-D 0.01 mg/L上，莖尖的分化率最高，為50%。在前一種培養基上有16.7%誘導出類原球莖，33.3%誘導出不定芽。后一種培養基上只誘導出類原球莖。在其他培養基上誘導率相對較低，多數外植體因褐化而死亡。

圖2 在1/2 MS培養基上NAA和2,4-D濃度梯度蝴蝶蘭花梗腋芽死亡率方差分析結果

圖3 在1/2 MS培養基上6-BA濃度梯度蝴蝶蘭花梗腋芽分化率方差分析結果

圖4 膨大的莖尖及莖尖產生的類原球莖

多元回歸分析表明，TDZ、NAA、2,4-D和6-BA對蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖分化率的影響中，6-BA和NAA對莖尖分化率影響較大(達到95%顯著水平)，但6-BA影響更強，TDZ和2,4-D未達到顯著程度(多元回歸分析結果未列出)。分別對6-BA和NAA與莖尖分化率做單因素方差分析，結果表明，隨6-BA濃度增加，蝴蝶蘭莖尖分化率增加。NAA的方差分析結果并不顯著(圖6)。

圖5 增殖的類原球莖

2.4原球莖增殖培養 將類原球莖切成0.5 cm2大小的塊，接種在附加不同濃度的NAA和6-BA的MS培養基上進行增殖培養，培養一段時間后，再進行切割轉移，通過這種方式使原球莖成倍增長。結果發現(表5)，在培養基MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，類原球莖增殖倍數最高，為4.7，產生的類原球莖顏色為綠色，顆粒狀，隨著培養時間的延長，有的類原球莖變為乳黃色(圖6)。因此，該培養基為蝴蝶蘭類原球莖增殖的最佳培養基。在培養基MS+6-BA 10 mg/L+NAA 0.5 mg/L上，原球莖在增殖的同時, 有的產生大量叢生芽, 但叢生芽長得較為弱小。可能是6-BA濃度過高導致的。因為細胞分裂素是一類較活躍的植物激素，它不僅能促進植物細胞的分裂和增大，而且在芽分化的誘導、葉綠體的發育、養分的運輸和分配、細胞衰老的抑制等方面都表現顯著的效果。

試驗發現，在增殖時一定要對類原球莖先切割后培養，這樣效果比不切割的要增殖的數量多。原球莖分化比較容易，原球莖在增殖后較長時間不進行轉移就能出現褐化現象。

2.5組培苗生根誘導和馴化移栽 組培苗生根的誘導也是植物組織培養能否成功的關鍵步驟。當再生苗長到1.2～2.0 cm時，繼代到附加0.5 mg/L NAA濃度的1/2 MS培養基中中進行生根誘導，50 d后統計生根情況。結果表明(圖7)，98%的無菌苗均生根。并且生長良好。經過馴化的組培苗移栽后生長良好，成活率為89.3%。

表4 在不同1/2 MS培養基上蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖的誘導及生長狀況

圖6 在1/2 MS培養基上不同6-BA和NAA濃度蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖分化率方差分析結果

表5 在MS培養基上的繼代增殖培養

圖7 生根和馴化的無菌苗

3 討論與結論

近年來，對蝴蝶蘭組織培養報道較多的是以僅開一兩朵花且下面花芽飽滿的花梗、幼葉、莖尖和根尖等多種器官為外植體進行組織培養研究[10]，但這些方法對母株都有不同程度的損傷。本研究選用的是幼嫩的花梗(為控制花期一致剪掉的花梗)作為外植體，經過多次試驗，初步建立了組織培養再生體系。雖然誘導率相對較低，但這樣既不損傷母株，又可節約成本，充分利用材料，繁殖大量優良品種，比采用蝴蝶蘭根尖、莖尖進行快速無性繁殖更有應用價值，特別是對一些稀有品種的保存和快繁[14]。

在植物組織培養中，外源生長素和細胞分裂素是細胞離體培養所必需的激素，合適的濃度及兩者之間的適宜配比不但可以誘導細胞分裂和生長，而且能控制細胞分化和形態建成[15]。王麗艷等[16]認為，激素是誘導組培苗增殖的關鍵物質，對培養的成敗起著決定性的作用。本研究結果證明激素種類和濃度對于花梗腋芽啟動培養有一定的影響。6-BA和 NAA的共同作用可以促進蝴蝶蘭花梗腋芽萌發，在培養基1/2 MS+6-BA 2 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L上，蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發率最高。不同的培養基對蝴蝶蘭莖尖的誘導效果不同，較高濃度的6-BA有助于莖尖原球莖的誘導和增殖，濃度低誘導效果相對較差[17]。在培養基1/2 MS+6-BA 6 mg/L+NAA 0.2 mg/L和1/2 MS+6-BA 5 mg/L+2,4-D 0.01 mg/L上，莖尖的分化率最高。在前一種培養基上有16.7%誘導出類原球莖，33.3%誘導出不定芽。后一種培養基上只誘導出類原球莖。在其他培養基上誘導率相對較低，多數外植體因褐化而死亡。在原球莖增殖培養過程中，在培養基MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，類原球莖增殖倍數最高，為4.7，產生的類原球莖顏色為綠色，顆粒狀。因此該培養基為蝴蝶蘭類原球莖增殖的最佳培養基。

金忠民等[18]認為提高愈傷組織誘導率是建立再生體系的第一步，沒有高頻的誘導率，便無法得到大量的、高品質的愈傷組織，其隨后的分化及生根也難以進行。對于蘭科植物來說，提高原球莖的誘導率則是建立再生體系的關鍵技術，本試驗原球莖的誘導率相對較低，有待于進一步深入研究提高類原球莖的誘導率。此外，越來越多的研究表明，蘭花類原球莖形成過程是典型的體細胞胚胎發生發育過程，且是單細胞起源的[19-20]。這為蘭科植物利用組織培養育種提供了理論基礎。組織培養也可以與化學誘變相結合的方法進行多倍體或抗性育種[21-23]。在蘭科植物種質資源創新方面具有較大的潛在應用價值。本研究為蝴蝶蘭的高頻再生組織培養體系建立、基因轉化、多倍體誘導或抗性育種奠定基礎。

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