TNF-α對銀屑病患者成纖維細胞基因表達的影響

武警陜西總隊醫(yī)院(西安 710054) 徐 皓 程隨濤 張衍國 呂雅潔 張惠中 余春艷

銀屑病是一種表皮過度增殖為特征的慢性皮膚病,發(fā)病機理尚不明確,近年來研究表明銀屑病皮損中成纖維細胞存在異常,認為成纖維細胞可能是銀屑病發(fā)病的重要因素之一。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為一種炎癥因子,在銀屑病的發(fā)病中具有重要作用,我們采用 GeneChip Human Genome U133 Plus2.0芯片研究以 TNF-α為刺激條件下,尋常型銀屑病患者成纖維細胞基因表達譜的變化情況,為進一步研究成纖維細胞在銀屑病發(fā)病中的作用提供相應(yīng)的理論支持。

材料與方法

1 材 料 胎牛血清購自杭州四季青公司,DMEM、PBS購自 GIBCO公司,硫酸鏈霉素、氨芐青霉素購自華北制藥股份公司,TRIZOL購自INVIT ROGEN公 司,TNF-α購 自 ABD公司。GeneChip Human Genome U133 Plus2.0芯片為Affymetrix公司產(chǎn)品。

2 方 法 ①成纖維細胞的培養(yǎng):見參考文獻[1]。利用小鼠抗型膠原一抗進行細胞鑒定。②TNF-α對皮膚成纖維細胞基因表達影響的檢測:實驗組加入 TNF-α15ng/ml,72h培養(yǎng),空白對照組未加。貼壁細胞培養(yǎng)誘導結(jié)束后,棄去培養(yǎng)液基。加入 Tizol,按照Trizol總 RNA抽提試劑盒說明書分別提取總 RNA,用電泳及分光光度計測 A260/A280鑒定 mRN A質(zhì)量。 RNA定量,反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA并進行純化。用Bio Array High Yield RNA Transcrip tLableling體轉(zhuǎn)錄合成生物素化 cRNA。cRNA片斷化,與Affymetrix133芯片雜交、染色、洗滌。

3 統(tǒng)計學分析 用 Microarray SuitVersion 5.0和 Data Mining Tool Version 2.0獲取芯片雜交信息,進行數(shù)據(jù)處理和分析。采用 Genmapp和 Mappfinder進行功能聚類和途徑分析,該軟件中的數(shù)據(jù)庫(生物途徑圖)來源于 KEGG數(shù)據(jù)庫,并與 Gene Ontology(GO)Consortium鏈接,在 Genmapp運行結(jié)果的基礎(chǔ)上,對基因差異表達數(shù)據(jù)在分析生物過程、分子功能和細胞組分進行聚類分析,并進行顯著相關(guān)性統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

1 雜交與掃描結(jié)果 將基因芯片與制備的探針雜交后,掃描 Cy3與 Cy5兩種熒光信號的強度和比值,用專用軟件分析,差異表達的標準為基因表達變化在 2倍以上者為陽性。根據(jù) GO分類與 GENE M APP分類,差異表達基因共有 730條,其中上調(diào)基因 395條,下調(diào) 335條。

2 散點圖分析 分別以參加比對兩組數(shù)據(jù)的對數(shù)值(Ln)作為橫縱坐標作圖,沿 45度對角線方向分布的基因,表示它在兩樣本中的表達量是相同的。距離對角線垂直距離越遠的基因,表示它在某一樣本中的差異表達程度越大。設(shè) R=S/C(S代表縱坐標上歸一化后的樣本數(shù)據(jù),C代表橫坐標上歸一化后的樣本數(shù)據(jù))。

3 功能聚類分析 對差異顯著基因,即變化倍數(shù)在 2倍及 2倍以上的基因進行 Mappfinder功能聚類分析。具體分布情況見表 1。

4 與免疫相關(guān)的基因名稱及生物學過程 見表2。

討 論

基因芯片的特點是大規(guī)模、高通量和高平行性地研究成千上萬個基因的表達情況,廣泛應(yīng)用于基因功能的研究[2]。銀屑病是一種以表皮過度增殖為特征的慢性皮膚病,病因和發(fā)病機制尚不清楚。現(xiàn)研究表明銀屑病患者成纖維細胞可維持銀屑病皮損表皮的高增殖狀態(tài),產(chǎn)生較高水平的 IL-6、IL-8[3]、角質(zhì)形成細胞生長因子[4]。故認為銀屑病成纖維細胞通過旁分泌釋放高水平的細胞因子可能是造成角質(zhì)形成細胞過度增殖的重要始動因素[5]。 TNF-α在銀屑病的發(fā)病中具有重要的作用。為了研究成纖維細胞在銀屑病發(fā)病中的作用,我們用基因芯片分析了在 TNF-α作用下,銀屑病患者成纖維細胞基因表達譜的變化。結(jié)果表明在TNF-α單一因素的作用下,銀屑病患者成纖維細胞基因表達譜發(fā)生了重大變化,有 730條基因表達有明顯變化,涉及合成、分解、加工、修飾、運輸、調(diào)控、細胞周期和凋亡等多個生物過程。在這些基因中,還有近 1/3的基因功能未知。提示在 TNF-α的刺激下成纖維細胞可能通過合成和分泌多種因子,造成細胞周圍環(huán)境的多因素變化,從而引起角質(zhì)形成細胞的過度增殖。其中涉及免疫的基因有 31條,在以往銀屑病研究中已有相關(guān)報道有 IL-15、 C3和 PLA2G4C,未見相關(guān)報道有IL-32、CD163、CD83、PTX3、鳥苷酸結(jié)合蛋白 (GBP1)等。IL-15在銀屑病皮損整個表皮以及直接與表皮基底細胞接觸的真皮細胞高表達,而在正常皮膚中只有表皮下部的角質(zhì)形成細胞表達[6]。我們實驗證實銀屑病患者成纖維細胞在 TNF-α的刺激下 IL-15的基因表達明顯升高,說明銀屑病患者皮損中的 IL-15不僅僅是來源于免疫系統(tǒng),真皮內(nèi)的成纖維細胞可能是皮損中 IL-15的重要來源,這與以往研究相符合,同時也證明我們試驗的可靠性與結(jié)果的可信性。C3在補體系統(tǒng)中主要參與旁路激活途徑,表現(xiàn)為感染早期的非特異性免疫,其水解片段具有多種生物活性,如過敏毒素作用、中性粒細胞的趨化作用,增強炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫功能和促進炎癥因子的產(chǎn)生等。C3對中性粒細胞具有趨化作用,中性粒細胞釋放的溶酶體激活補體,形成中性粒細胞、T淋巴細胞、角質(zhì)形成細胞的相互作用惡性環(huán)路,促使銀屑病反復發(fā)作及慢性化。

表1 按照 GO標準進行生物學活性過程分類

表2 與免疫相關(guān)的基因名稱及生物學過程

PLA2G4C磷脂酶 A2(PLA2)是一類催化磷脂二位酰基水解的酶族,是花生四烯酸、溶血磷脂等炎性介質(zhì)生成的限速酶,促進炎性介質(zhì)和細胞因子的釋放和激活,直接影響炎性病變的發(fā)展和預(yù)后。雖然沒有直接證據(jù)證明 PLA2與銀屑病發(fā)病相關(guān),但是體外試驗表明 PLA2通過酶解產(chǎn)物花生四烯酸,誘導角質(zhì)形成細胞殖[7]。因此 PLA2可能與銀屑病發(fā)病相關(guān)。

IL-32是先天免疫中的關(guān)鍵效應(yīng)器。具有趨化外周血單核細胞作用。 IL-32 α通過活化 NF-κ B和 p38 MAPK的磷酸化誘導多種炎癥因子包括 TNF-α的表達。本實驗結(jié)果提示銀屑病患者成纖維細胞在 TNF-α的刺激下,釋放 IL-32,IL-32誘導產(chǎn)生 TNF-α,放大TNF-α的效應(yīng),參與了銀屑病 TNF-α惡性循環(huán)的形成。CD163血色素-結(jié)合珠蛋白復合物的受體,通過調(diào)節(jié)血紅素氧合酶-1的表達,參與抗炎、抗氧化作用。CD163具有單核細胞-巨噬細胞特異性,在炎癥組織或血液循環(huán)的單核細胞中,CD163的表達增高。IL-6,IL-10和糖皮質(zhì)激素促使 CD163表達上調(diào),而干擾素和TNF-α使其表達下調(diào)[8]。本試驗表明 CD163可能不僅僅表達在單核細胞和巨噬細胞上,也表達在成纖維細胞上,在 TNF-α刺激下成纖維細胞的 CD163基因表達不是降低,而是明顯增高。這與以往的研究結(jié)果不符,是否由于銀屑病患者的成纖維細胞功能紊亂造成,還需進一步深入研究。

CD83是細胞表面Ⅰ型膜糖蛋白。不僅僅是成熟樹突狀細胞(DC)的標志,還是 DC發(fā)揮其激發(fā)免疫應(yīng)答作用中不可缺少的功能分子。分為膜結(jié)合型和可溶型,膜結(jié)合型 CD83增強 T細胞應(yīng)答,促進免疫反應(yīng)的作用。可溶性 CD83具有強大的免疫反應(yīng)抑制作用,抑制DC的成熟和 T細胞的增殖[9]。 PTX3結(jié)合蛋白相關(guān)基因,是 TNF誘導表達基因之一。作為炎癥急性期反應(yīng)蛋白,PTX3特異性結(jié)合在凋亡細胞的細胞核膜上,能夠提高血管內(nèi)皮細胞對 TNF的敏感性,提高細胞合成 TNF誘導的細胞因子。GBP1鳥苷酸結(jié)合蛋白(GBP1),簡稱 G蛋白。 由α、β和γ三個亞單位組成,α亞單位上有鳥苷酸結(jié)合位點。主要在激素受體結(jié)合的部分與腺苷環(huán)化酶之間起調(diào)節(jié)作用。當 G蛋白上結(jié)合的鳥苷酸為 GT P時則激活而發(fā)揮作用,但當 G蛋白上的 GTP水解為 GDPA時則失去活性。當激素與受體結(jié)合時,活化的受體與 G蛋白的α亞單位結(jié)合,促使其與β、γ亞單位脫離,通過對腺苷酸環(huán)化酶起激活或抑制作用,從而實現(xiàn)激素對細胞內(nèi)功能的調(diào)節(jié)。

試驗中銀屑病患者成纖維細胞在 TNF-α的刺激下,不僅僅是激活免疫的細胞因子基因表達增高,而且抑制免疫的細胞因子基因表達也升高。此外還涉及到炎癥、細胞增殖與凋亡等多方面原因,其病理變化不是一種細胞因子造成的,而是多種細胞因子共同改變的結(jié)果,許多基因其生物學過程與功能并不是十分清楚。越來越多的研究表明 TNF-α與銀屑病關(guān)系密切。說明銀屑病患者皮膚成纖維細胞可能合成免疫相關(guān)細胞因子的功能失衡,在銀屑病的發(fā)病中具有重要的意義。這些免疫相關(guān)的基因與銀屑病的發(fā)病關(guān)系還需進一步深入研究。

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