飼用高產纖維素酶菌株的誘變選育

東北農業大學 張曉烜 王傲雪*

纖維素是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物，也是地球上數量最大的可再生資源。目前，自然界中的纖維素只有一小部分得到了利用，絕大多數纖維素被白白浪費掉，而且還造成了環境污染。利用微生物生產的纖維素酶將纖維素轉化為人類急需的能源、食物、飼料和化工原料等，對解決環境污染、食物短缺和能源危機具有重大的現實意義（馬旭光等，2006）。要使纖維素酶真正能夠用于工農業生產，首先要降低纖維素酶的成本，新菌株的選育是纖維素酶科學研究的一個重要課題，誘變育種是其中的重要方法（汪維云等，1998）。纖維素酶產生菌主要有木霉、青霉和曲霉等，其中里氏木霉對牲畜無毒害作用，且其生產條件比較容易控制。但目前是高產纖維素酶的里氏木霉菌株較少（徐昶，2005）。本文利用三種誘變因子對里氏木霉40359進行高產纖維素酶的選育，得到了一株穩定高產的菌株YB40359。

1 材料與方法

1.1 材料與設備 里氏木霉菌株40359（購于中國農業微生物菌種保藏中心）。馬鈴薯、小麥麩皮、（市售）葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、酵母膏、微晶纖維素、剛果紅染料、脫氧膽酸鈉、羧甲基纖維素鈉、KH2PO4、（NH4）2SO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、Tween-80、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、NaNO2、DES（硫酸二乙酯），3，5-二硝基水楊酸（DNS）、酒石酸鉀鈉、結晶酚、無水亞硫酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、羧甲基纖維素鈉、水楊酸苷（所有試劑均為分析純）、新華定量濾紙。

培養皿、培養箱、超凈工作臺、搖床、恒溫水浴鍋、離心機、720型分光光度、20 W紫外照射儀、磁力攪拌器、手提式壓力滅菌器。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養 將提純復壯后的里氏木霉40359（經傳代試驗酶活穩定）接種在PDA培養基上，25℃培養6 d后備用。

1.2.2 培養基配制 菌種斜面復活培養基：PDA培養基；平皿初篩培養基（剛果紅瓊脂培養基）上層培養基：微晶纖維素（或羧甲基纖維素鈉）1%、纖維二糖1%～2%、瓊脂2%、脫氧膽酸鈉0.12%、剛果紅0.01%，溶于Mandel’s營養液中；下層培養基：2% 的瓊脂溶于 Mandel’s營養液中；液體發酵培養基：蛋白胨0.3%，硫酸銨0.2%，酵母膏 0.05%，KH2PO40.4%，CaCl2·2H2O 0.03%，MgSO4·7H2O 0.03%，Tween-80 0.02%，微晶纖維素2%，小麥麩皮3%，121℃滅菌20 min后使用。

1.2.3 誘變劑及誘變劑量的選擇 紫外線誘變將培養好斜面菌種用無菌水洗下孢子，調整孢子濃度為107。開啟紫外燈預熱30 min，取3 mL制備好的孢子液于無菌培養皿中（?6 cm）中，紫外燈功率為20 W，照射距離為30 cm，分別照射5、10、15、20、25 min。將照射后的菌液稀釋成不同梯度后，各取0.1 mL均勻涂布于剛果紅培養基平板上，在皿蓋上標明稀釋度及輻照時間，用報紙包起黑暗培養24 h，后打開報紙進行培養。取未經紫外線照射的孢子液，稀釋相同梯度涂于剛果紅培養基，作為對照。

紫外線和亞硝酸鈉復合誘變：將經紫外線誘變篩選的菌株斜面培養，分別用10 mL無菌生理鹽水將孢子洗下，振蕩，血球記數板記數，調整孢子濃度為108個/mL菌液。取1 mL菌液，分別用0.1 mol/L 的亞硝酸鈉 2 mL 處理 3、5、8、10、13、15、18 min后，加無菌生理鹽水大量稀釋終止反應。將不同處理的菌液稀釋不同濃度后，用移液槍各移取0.1 mL涂布接種于剛果紅培養基，黑暗培養1 d，后打開報紙。取未經亞硝酸鈉處理的孢子液，稀釋相同梯度涂于剛果紅培養基作為對照。

紫外線、亞硝酸鈉與硫酸二乙酯（DES）的復合誘變：用無菌生理鹽水10 mL將經過紫外線和亞硝酸鈉復合誘變后篩選出的斜面菌株洗下，振蕩均勻，調整孢子數目至106個/mL菌液，取1 mL菌液加入 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL 硫酸二乙酯，振蕩，使之分布均勻，30 min后，無菌生理鹽水大量稀釋終止反應，將處理后的菌液稀釋不同濃度后，各取0.1 mL反應后的菌液涂布接種于剛果紅瓊脂平板，暗培養10 h，后正常培養。確定硫酸二乙酯的用量。取未經硫酸二乙酯處理的孢子液，稀釋相同梯度涂于剛果紅培養基作為對照。

1.2.4 初選 將誘變得到的孢子液涂布于剛果紅培養基，28℃，培養3～5 d，挑取透明圈直徑/菌落直徑（H/C）大的平板菌落作為菌種。移接到三角瓶中，經180 r/min，28℃，6 d搖瓶培養后，測定濾紙酶活，酶活較高的菌株作為初篩優良菌株。

1.2.5 復篩 把初篩的優良菌株（選取透明圈出現較早，H/C較大的菌株）接種到液體發酵培養基三角瓶中，經180 r/min，28℃，6 d搖瓶培養后，測定濾紙酶活和CMC酶活，與對照組相比，菌株發酵液酶活力≤90%的為負突變株，酶活力≥110%的為正突變株，酶活力在90%～110%的為非變異株。把酶活較高的菌株作為復篩的優良菌株，將其命名為YB40359。正突變率（初篩）=誘變后H/C大于出發菌株的菌落總數／誘變后存活的菌落總數100%。

1.2.6 酶活測定 粗酶液的制備 將液體搖瓶發酵得到的液體轉移到無菌的1.5 mL離心管中，6000 r/min離心5 min，吸取上清液轉移到新的離心管中，備用。羧甲基纖維素酶活（CMCase）、濾紙糖酶活（FPA，FPase）的測定 參考吳丹（2007）。 酶活的計算方法：

式中：5.56為 1 mg葡萄糖的μmol數（1000/180=5.56）。

2 結果與分析

2.1 紫外線最適劑量的選擇 由圖1可知，隨著紫外線的輻照時間的延長，菌株的死亡率逐漸上升，存活曲線呈現指數型的“肩型”。照射15 min時其存活率只有13.28%；30 min的照射幾乎沒有存活的菌體，致死率最大，達到了99.63%。而其正突變率則有先升后降的趨勢，其中照射15 min時，菌株致死率為86.62%；初篩正突變率最高為7.60%，所以初步選擇15 min為UV誘變照射時間。

圖1 出發菌株的紫外線輻照誘變

2.2 亞硝酸鈉最適劑量的確定 選擇經UV輻照后篩選出的優良菌株，取1 mL孢子液加入0.1 mol/L的亞硝酸鈉2 mL，25℃處理不同時間（圖2）。試驗結果表明，在NaNO2處理15 min時，菌體的死亡率87.59%；正突變率最高為9.37%。

圖2 亞硝酸鈉的誘變效果

2.3 DES最適劑量的確定 取里氏木霉40359經UV輻照和NaNO2處理后選育出的優良菌株，取1 mL孢子液再經DES處理（圖3）。由試驗結果可以看到，DES+UV+NaNO2協同對里氏木霉40359的損壞致死作用較大，DES、NaNO2破壞細胞染色體的堿基的能力強，導致DNA多點突變。用較少的劑量，細胞的死亡率就已經很高，采用不同DES劑量，相同時間處理（30 min）。當在1 mL菌液里加入0.06 mLDES時，致死率達到94.36%，正突變率較高達到11.08%。

2.4 初篩 本試驗利用UV（20 W，30 cm處，輻照 15 min），0.1 mol/L NaNO2處 理 15 min，0.06 mL DES處理30 min的協同、多輪復合誘變。誘變菌株在剛果紅平板上透明圈出現時間較快，H/C也較大，屬于正常突變株。大部分再生菌株的生長不旺盛，產孢量少，顏色黃綠色，淺于出發菌株。根據篩選平板上出現水解圈的情況，挑取在剛果紅平板上菌落凸起、黃綠色、H/C較大的菌株，作為產酶初篩菌株。

圖3 硫酸二乙酯的誘變效果

2.5 復篩 經過初篩共得到40個菌株，將初篩得到的菌株用接種針點接種于馬鈴薯培養基平板上，活化復壯菌種，以未經過誘變的菌株作為對照。分別接種于液體發酵培養基28℃、180 r/min，培養144 h后測定酶活。由于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶產量較小，所以在復篩過程中沒有測其含量。

由表1可以看出，在40株初篩突變菌株中，有3株負突變株，占7.5%；有4株非變異株，占10%；有33株正突變株，占82.5%。（對照1為野生菌株，對照2為經紫外線和亞硝酸鈉誘變后的菌株 40359 b）。

將所有正突變株進行遺傳穩定性試驗，結果表明28號菌株的搖床發酵液的酶活力較高，且在連續7代試驗遺傳穩定性較好，命名為YB 40359，作為生產菌株。

表1 誘變菌株生產纖維素酶的能力 U/mL

由表2可知，28號菌株發酵培養后，FPA酶活力達到57.31 U/mL，較原始菌株提高了87.12%；CMC酶活達到142.60 U/mL，較原始菌株提高了58.66%。

表2 誘變菌株YB 40359遺傳穩定性狀的檢測 U/mL

3 結論

3.1 紫外線、亞硝酸鈉和硫酸二乙酯最適劑量的確定 里氏木霉40359的紫外線最適劑量為：紫外燈20 W、照射距離30 cm、輻照時間15 min；亞硝酸鈉的最適劑量為 0.1 mol/L、25℃處理 15 min；硫酸二乙酯0.06 mL處理30 min。

3.2 里氏木霉40359誘變選育結果 本研究采用紫外線、亞硝酸鈉和硫酸二乙酯對里氏木霉40359進行低劑量復合誘變，經過反復誘變得到高產纖維素酶菌株YB40359，液體搖瓶試驗表明：其發酵培養后，FPA酶活力達到57.31 U/mL，較原始菌株提高了87.12%；CMC酶活達到142.60 U/mL，較原始菌株提高了58.66%，可作為纖維素酶生產菌株。

[1]馬旭光，張宗舟，藺海明，等.黑曲霉產高酶活纖維素酶突變株ZM-8的篩選[J].飼料工業，2006，27（24）：11 ～13

[2]汪維云，朱金華，吳守一.纖維素科學及纖維素酶的研究進展[J].江蘇理工大學學報，1998，19（3）：20 ～28

[3]徐昶,龍敏南,鄔小兵,等.高產纖維素酶菌株的篩選及產酶條件研究[J].廈門大學學報（自然科學版），2005，44（1）：107 ～111.

[4]吳丹.高產纖維素酶菌株的分離鑒定，誘變選育及產酶條件的研究：[碩士研究生論文][D].南昌：南昌大學，2007，6：19 ～20.