液相色譜法測(cè)定飼料添加劑L-肉堿鹽酸鹽

上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 林 淼 趙志輝

左旋肉堿（L-carnitine）具有提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力、抗應(yīng)激能力，改善肉品質(zhì)，提高存活率等作用（周鍵鴻和劉冬生，1996）。它常以鹽酸鹽的形式存在，即L-肉堿鹽酸鹽（左旋肉堿鹽酸鹽）。我國(guó)在1999年7月26日，由農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《允許使用的飼料添加劑品種目錄》中，L-肉堿鹽酸鹽被列入其中。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是采用非水滴定法。以冰乙酸為溶劑，結(jié)晶紫為指示劑，高氯酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定L-肉堿鹽酸鹽結(jié)構(gòu)中的堿性氮（飼料添加劑 左旋肉堿 NY/T1028-2006）。此方法的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便，容易操作，成本較低，然而存在的缺點(diǎn)是無(wú)法排除其他含有堿性氮結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（如甜菜堿、氯化膽堿等飼料添加劑）干擾。由于L-肉堿鹽酸鹽具有紫外吸收基團(tuán)，在210 nm處有最大吸收峰，同時(shí)在酸性流動(dòng)相中與庚烷磺酸鈉能夠結(jié)合形成疏水性離子對(duì)，可經(jīng)反相色譜分離（趙榕等，2004）。因此本實(shí)驗(yàn)中建立反相液相色譜法測(cè)定L-肉堿鹽酸鹽。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 方法原理 飼料添加劑中L-肉堿鹽酸鹽用二次蒸餾水超聲提取。在酸性流動(dòng)相中與試劑庚烷磺酸鈉結(jié)合形成疏水性離子對(duì)，經(jīng)反相色譜分離。

1.2 試劑與材料

1.2.1 試劑 甲醇：色譜純；流動(dòng)相：稱取3.4 g磷酸二氫鉀溶液（0.05 mol/L）及0.20 g庚烷磺酸鈉（0.002 mol/L）溶于500 mL水中，用磷酸調(diào)pH=2.5，甲醇（色譜純）含量為5%。

除特殊說(shuō)明，所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2.2 L-肉堿鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取L-肉堿鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司提供）0.0200 g，用二次蒸餾水溶解并定容于10.0 mL，此溶液含L-肉堿鹽酸鹽為2.0 mg/mL。

1.3 儀器與設(shè)備 Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)：配有2487紫外檢測(cè)器；超聲波提取器；溶劑微孔過(guò)濾器帶0.22 μm水相濾膜；離心機(jī)：10000 r/min。渦旋振蕩器。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試樣制備 試樣取20 g左右，混合均勻，粉碎，稱取0.1 g（含L-肉堿鹽酸鹽50～100 mg）于100 mL容量瓶中，加入二次蒸餾水約50 mL，超聲提取30 min，用二次蒸餾水定容，混勻，離心，棄初濾液數(shù)毫升，收集濾液，過(guò)0.22 μm水相濾膜。濾液直接供HPLC分析。

1.4.2 色譜分析 色譜條件：ASB VS851505-0；色譜柱：C8柱，4.6 mm × 150 mm；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣10 μL進(jìn)樣。根據(jù)保留時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)加入法定性，試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積比較定量。

1.4.3 結(jié)果計(jì)算 X=Cs×V×W×n/m；W=A/As。

式中，X為試樣中L-肉堿鹽酸鹽含量，mg/g；Cs為標(biāo)準(zhǔn)溶液L-肉堿鹽酸鹽的濃度，mg/mL；V為試樣定容體積，mL；m為試樣重量，g；A為試樣溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液L-肉堿鹽酸鹽對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱選擇 由于L-肉堿鹽酸鹽極性較強(qiáng)，普通的C8柱對(duì)其保留很弱，即使加入離子對(duì)試劑也很難滿足分離要求。于是測(cè)試了ASB反相色譜柱，由于其耐水性強(qiáng)（可使用100%水為流動(dòng)相），并且極性很強(qiáng)，對(duì)極性化合物具有很強(qiáng)的分離能力，增強(qiáng)了肉堿的保留能力，可滿足分析要求。

2.1.2 緩沖體系 離子對(duì)反相液相色譜要求較嚴(yán)格的pH值范圍，對(duì)檸檬酸及磷酸鹽緩沖體系分別進(jìn)行了測(cè)試，使用檸檬酸緩沖體系時(shí)，靈敏度低且出峰時(shí)間過(guò)早（2.5 min出峰），不宜與溶劑峰分離（兩種緩沖體系的疊加色譜圖見(jiàn)圖1），所以選擇磷酸二氫鉀-磷酸作為緩沖體系。通過(guò)對(duì)磷酸二氫鉀濃度以及pH值的選擇，當(dāng)磷酸二氫鉀濃度為0.05 mol/L、pH值為2.5時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品、飼料添加劑L-肉堿鹽酸鹽均可以得到較穩(wěn)定的分離測(cè)定結(jié)果。

2.1.3 有機(jī)相 分別對(duì)乙腈和甲醇進(jìn)行了測(cè)試，使用乙腈出峰時(shí)間過(guò)早，不易分離。使用甲醇作為有機(jī)相時(shí)可以得到較好的分離效果。隨著甲醇濃度的不斷加大，L-肉堿鹽酸鹽的保留時(shí)間不斷縮短，在5%甲醇的色譜條件下，出峰時(shí)間為4 min左右，不受雜質(zhì)及試劑的干擾，能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 兩種緩沖體系的疊加色譜圖

2.1.4 離子對(duì)試劑 在1.0、2.0 mmol/L及3.0 mmol/L濃度下，分別對(duì)離子對(duì)試劑庚烷磺酸鈉的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，隨著庚烷磺酸鈉濃度的加大，肉堿的保留時(shí)間增長(zhǎng)。但是，離子對(duì)試劑對(duì)色譜柱損害較大，因此，庚烷磺酸鈉的濃度定為2.0 mmol/L。

因此，在0.05 mol/L磷酸二氫鉀、2.0 mmol/L庚烷磺酸鈉、pH=2.5、5%甲醇的色譜條件下，肉堿出峰時(shí)間為4 min左右，不受雜質(zhì)及試劑的干擾，能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 提取條件的選擇 酸性條件有利于L-肉堿鹽酸鹽與庚烷磺酸鈉形成穩(wěn)定的離子對(duì)，因此測(cè)試了用0.50 mmol/L鹽酸和純水提取試樣中L-肉堿鹽酸鹽。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用0.50 mmol/L鹽酸與用純水提取效果均較好，但用鹽酸提取時(shí)溶劑峰很高，不利于觀察，而且用純水提取方法簡(jiǎn)單，因此本方法選擇純水作為提取液。在上述優(yōu)化條件下得到了500 μg/g的L-肉堿鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)譜圖（圖2）。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

2.3 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 選取3批不同含量的L-肉堿鹽酸鹽飼料添加劑，按照本方法確定的條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每批樣品分別制備5份溶液，每個(gè)濃度測(cè)定3次取平均值，測(cè)試L-肉堿含量，得到變異系數(shù)分別為0.28%、0.33%和0.25%，結(jié)果表明，本方法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)4種飼料添加劑產(chǎn)品進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)（n=3），結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在上述優(yōu)化條件下本實(shí)驗(yàn)方法可行。

2.5 方法線性范圍及檢出限 配制一系列不同濃度（25～4000 μg/g）的L-肉堿鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述優(yōu)化條件下測(cè)得峰面積，以峰面積對(duì)濃度作圖，得到了L-肉堿鹽酸鹽的工作曲線。以信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)濃度確定檢測(cè)下限，得到線性回歸方程為y=118.29x-1987.5，相關(guān)系數(shù)r=0.9999；檢出限為 7.5 μg/g。

表1 回收率結(jié)果（n=3）

2.6 抗干擾實(shí)驗(yàn) 甜菜堿和氯化膽堿是兩種與L-肉堿鹽酸鹽類(lèi)似的含堿性氮結(jié)構(gòu)的飼料添加劑。非水滴定法無(wú)法區(qū)分這幾類(lèi)物質(zhì)。為了確定檢測(cè)到的物質(zhì)不是同類(lèi)物質(zhì)，用本方法的色譜條件對(duì)這兩種飼料添加劑進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果如圖3、4所示。甜菜堿保留時(shí)間為2.7 min，而氯化膽堿在此條件下無(wú)響應(yīng)，表明這兩種物質(zhì)不會(huì)對(duì)L-肉堿鹽酸鹽造成干擾。

圖3 500 μg/mL甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

圖4 500 μg/mL氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

3 實(shí)際樣品的測(cè)定

用所建立的方法檢測(cè)了3家不同廠家飼料添加劑（其中選取典型圖譜見(jiàn)圖5）。由圖5可見(jiàn)，3.5 min所檢測(cè)出的色譜峰即為L(zhǎng)-肉堿鹽酸鹽。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，可計(jì)算出樣品中L-肉堿鹽酸鹽含量。

4 兩種方法比對(duì)

選取不同廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品，分別按照上述兩種方法（液相色譜法和非水滴定法）確定的試驗(yàn)條件進(jìn)行含量的測(cè)定，每種樣品測(cè)定3次，取平均值，其對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，兩者無(wú)顯著差異。

圖5 飼料添加劑L-肉堿鹽酸鹽譜圖

表2 化學(xué)滴定法與液相色譜法檢測(cè)L-肉堿鹽酸鹽含量對(duì)比檢驗(yàn)結(jié)果（n=3） %

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)條件下HPLC法測(cè)定飼料添加劑L-肉堿鹽酸鹽，方法快速、簡(jiǎn)便和靈敏，與傳統(tǒng)非水滴定法結(jié)果相同，同時(shí)具有抗干擾的優(yōu)點(diǎn)。為L(zhǎng)-肉堿鹽酸鹽的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[1]周鍵鴻，劉冬生.強(qiáng)化L-肉堿對(duì)幼鼠生長(zhǎng)和脂肪代謝的影響[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，1996，18（2）：209 ～213.

[2]趙榕，孫開(kāi)奇，羅仁才.離子對(duì)反相高效液相色譜法測(cè)定保健食品中肉堿[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法，2004，14（4）：25 ～26.

[3]NY/T1028-2006飼料添加劑 左旋肉堿[S].北京：中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)，2009-5-26.