釀酒酵母表達基因工程抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性研究

深圳市圣西馬生物技術有限公司 張 捷 鄭文官 黃 杰 董清風 彭永鶴 李永新

抗菌肽在體外可直接殺滅病原微生物，具有廣譜抗菌活性：不僅可以抗革蘭氏陽性菌（G+）、革蘭氏陰性菌（G-）和真菌、原蟲等多種病原微生物，還可以抗腫瘤和癌細胞，甚至可以直接殺滅流感、皰疹等有包膜的病毒，是宿主防御外界病原體入侵的重要分子屏障。目前抗菌肽已在醫藥、食品防腐、化妝品及動物養殖領域等應用?；蚬こ炭咕腜a-AMP05為釀酒酵母分泌型表達，主要存在于發酵液的上清液中，具有多項免疫功能（王凱等，2009a，b；皮燦輝等，2008）及較高的穩定性，且動物試驗表明，其可以顯著促進動物生產性能和健康水平（李永新等2009，羅治華等，2009）。本實驗通過瓊脂擴散法、微量稀釋法和常量稀釋法，對其抗菌活性進行研究，以此確證基因工程抗菌肽Pa-AMP05的高效抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 基因工程抗菌肽Pa-AMP05發酵液（抗菌肽含量：500 μg/L）由深圳市圣西馬生物技術有限公司提供。指示菌大腸桿菌ATCC25922與金黃色葡萄球菌ATCC29213由華南農業大學獸醫學院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因工程抗菌肽Pa-AMP05發酵過濾液的制備 吸取10 mL的基因工程抗菌肽Pa-AMP05發酵液原液分裝到離心管，10000 r/min離心10 min，經孔徑為0.22 μm無菌濾膜過濾，備用。

1.2.2 大腸桿菌和金黃色葡萄球的制備 將大腸桿菌和金黃色葡萄球接入LB液體培養基中，37℃培養，使其菌數達到1×109CFU/mL備用。

1.2.3 瓊脂擴散法 參照藥敏試驗中瓊脂打孔擴散法，把金黃色葡萄球菌和大腸桿菌原菌液濃度調至1×105CFU/mL，將細菌均勻涂布到LB培養基上，將滅菌的不銹鋼小管（外徑為5 mm）放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用滅菌針頭挑出，并以火焰封底，使培養基能充分與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。

加樣：1號和2號孔分別加入發酵過濾液，陽性（+）孔加入抗生素(100 μg/mL Zeocin，Invitrogen）、陰性（-）孔加入空載體酵母發酵過濾液，各加至滿而不溢為止。

將平皿培養基置于37℃溫箱中培養15 h后，觀察抑菌結果并測量抑菌圈直徑。

1.2.4 微量稀釋法檢測抗菌肽抗菌活性

1.2.4.1 最小抑菌濃度（MIC）的測定 把已培養好的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌原菌液用LB液體培養基稀釋到 1000倍（1×106CFU/mL）。

在96孔板每個孔加入空白LB液體培養基100 μL。根據設計的實驗濃度，在第一列加入100 μL 待測樣品，吸取 100 μL 至第二孔，上下吹打，混合均勻后吸取100 μL至第三孔，第4～8孔操作相同，最后100 μL棄去。這樣每孔對應的體積分數為 1、1/2、1/4、1/8。 第 9孔和第 10孔分別做陽性對照（青霉素鈉）和陰性對照（滅菌水）?？股兀ㄇ嗝顾剽c200 μg/mL）操作方法同上。最后在每孔中加入100 μL稀釋好的菌液，放入恒溫培養箱中過夜培養。

1.2.4.2 結果判斷 以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陽性對照孔（即不含抗菌物質）內細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時，應記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度。如出現多處跳孔，則不應報告結果，需重復試驗。

1.2.5 常量稀釋法檢測抗菌肽抗菌活性 參照藥敏試驗中常量肉湯稀釋法，略有改動。

1.2.5.1 培養物的制備及培養檢測 按照不同稀釋比例：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 配置含有發酵過濾液的LB液體培養基，分為7個平行管，其中3管按1%接種量接入大腸桿菌，另3管按1%接種量接入金黃色葡萄球菌，同時留一管作為對照管，不接菌種。

以無菌水與2倍濃度LB培養基按1∶1混合溶液作為陰性對照，以無菌水為檢測OD600值所用參比樣品。將以上所有試管封口后放入37℃的恒溫搖床（250 r/min）里培養12 h，檢測其OD600值。

1.2.5.2 抗菌活性的檢測 終OD600值=樣品OD600值-相應消除管OD600值。

1.2.5.3 抗菌肽濃度與抗菌活性的線性關系測定將檢測得到的終OD600值與抗菌肽發酵過濾液稀釋倍數做線性回歸分析，根據R2值判斷二者是否具有線性關系，以此證明抗菌肽濃度與抗菌活性的線性關系。

2 數據與結果

2.1 瓊脂擴散法檢測基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性 實驗發現，抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好的抑菌效果。其對金黃色葡萄菌的抑菌圈直徑大小為12 mm，與抗生素陽性對照（100 μg/mL Zeocin）相同。對大腸桿菌的抑菌圈大小為15 mm，與抗生素陽性對照（100 μg/mL Zeocin）相同。

2.2 微量稀釋法檢測基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性 通過微量稀釋法檢測出抗菌肽及青霉素鈉的MIC值，結果見表1所示。

表1 微量稀釋法檢測基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性

結果測得青霉素鈉對金黃色葡萄球菌的MIC 值為：3.125 μg/mL， 對大腸桿菌的 MIC 值為：25 μg/mL?？咕膶瘘S色葡萄球菌MIC值均為15.625 μg/mL，對大腸桿菌的MIC值均為31.25 μg/mL。

2.3 常量稀釋法檢測基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性 結果見表2。結果表明，以基因工程抗菌肽發酵過濾液的稀釋倍數為橫坐標，分別以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養液的OD600值為縱坐標，做線性回歸分析，結果如圖1、2。結果表明，回歸方程分別為y=0.0206x-0.0952，R2=0.967；y=0.0051x+0.0234，R2=0.9749，即抗菌肽濃度與抗菌活性呈一定的線性正相關關系。

3 結論

目前，瓊脂擴散法、微量稀釋法和常量稀釋法為常用的抗菌活性檢測方法，通過測定發現，基因工程抗菌肽Pa-AMP05具有較強的抑制大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的活性，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為 15.625 μg/mL，對大腸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為31.25 μg/mL；同時檢測的青霉素鈉對金黃色葡萄球菌的MIC值為：3.125 μg/mL， 對大腸桿菌的 MIC 值為：25 μg/mL。通過線性回歸分析表明，基因工程抗菌肽Pa-AMP05的濃度與抗金黃色葡萄球菌活性呈一定的線性正相關關系。本試驗中由于抗菌肽Pa-AMP05對大腸桿菌的MIC值低于對金黃色葡萄球菌的MIC值，做回歸方程所選取的數據，稀釋倍數最高達到64倍，遠遠高于抗菌肽Pa-AMP05對大腸桿菌的MIC值范圍，導致回歸方程截距為負值，但是這并不影響其線性關系的判斷，即抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性強弱可以反映出發酵液中抗菌肽濃度的高低。此試驗結果說明，基因工程抗菌肽Pa-AMP05對所選取的代表性G+、G-具有很好的抑菌活性，具有廣譜的抗細菌性能。

表2 常量稀釋法檢測基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性

圖1 基因工程抗菌肽Pa-AMP05濃度與大腸桿菌抗菌活性的線性關系

圖2 基因工程抗菌肽Pa-AMP05濃度與金黃色葡萄球菌抗菌活性的線性關系

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