內皮祖細胞移植對犬心肌梗死后血管新生、心肌修復及心功能的影響*

陳圖剛 譚維羚 馬戰清 鐘志英 孫國鋒 周宇昕

（南昌大學第四附屬醫院 江西南昌330003）

血管內皮祖細胞 (endothelial progenitor cells,EPCs)是血管內皮的前體細胞。新近研究表明血管內皮祖細胞不僅參與胚胎期的血管發育，也存在于成年機體的骨髓及外周血中，在成體血管新生中起重要作用[1]。在組織損傷、缺血或梗死灶中有骨髓來源的血管內皮祖細胞聚集，并在原位分化為成熟內皮細胞形成新的血管。這一重大發現為缺血性疾病的治療提供了新的方法。本實驗采用犬外周血血管內皮祖細胞體外擴增后，在超聲引導下，經皮穿刺行心肌梗死犬心外膜下移植EPCs，觀察其對急性心肌梗死后心肌再生及心功能改變的影響，并評價移植的效果及安全性，以探索促進組織或器官血管新生的新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性家犬麻醉后平臥于設有大型X線機手術臺上，經右側股動脈穿刺置入6F動脈鞘管，經股動脈彈丸式注入肝素鈉2 500 U，后每隔1 h追加肝素鈉1 250 U。用經塑型的冠脈指引導管行冠脈造影，造影后置入PTCA球囊導絲，在導絲指引下置入2.5 mm×20 mm球囊至前降支前中段交界處以4～6 atm打開球囊堵塞冠脈，造影示球囊遠端血流中斷。球囊保持充盈90 min，此間持續監測壓力及電活動。術后每天肌肉注射青霉素160萬U，持續3 d。

1.2 犬EPCs培養、鑒定

1.2.1 EPCs的采集、分離和培養 犬心肌梗死2周后，采用密度梯度離心法從外周血獲得單個核細胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養板上。M199培養基（含20%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL）培養4 d，用PBS洗掉非貼壁細胞，換培養液繼續培養至7 d，用PBS洗掉非貼壁細胞，貼壁細胞供實驗用。

1.2.2 EPCs的 鑒 定 細胞與 acLDL-Dil（2.4 μg/mL）37℃下孵育1 h以檢測EPCs對DiLDL的攝取。然后用2%多聚甲醛固定細胞10 min。固定后用 PBS浸洗，將FITC-UEA-Ⅰ（10 g/mL）加于上述標本于37℃下孵育1 h。激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope,LSCM,Leica）鑒定FITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs，在倒置熒光顯微鏡下對每孔計數。細胞表型檢測：用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞并計數，將2×105貼壁細胞分別與PE標記的VEGFR-2、AC133和CD34單克隆抗體在4℃孵育30 min后，用PBS洗細胞2次，最后用300 μL PBS懸浮細胞后于流式細胞儀上檢測。

1.3 實驗分組及經皮穿刺行心肌梗死犬心外膜下移植EPCs 犬心肌梗死模型手術后4周，再次經肌肉注射氯胺酮（5 mg/kg）和速眠新（0.08 mL/kg）誘導麻醉，將動物平臥于動物實驗臺上，隨機分成兩組行細胞移植術，一組為對照組，注入2 mL生理鹽水（n=6）；另一組注入 2 mL EPCs（n=6）。左心前區皮膚消毒，鋪無菌巾，二維超聲心動圖直引下，穿刺心外膜下心肌，監測電極顯示ST段抬高，即注入細胞懸液0.2 mL，改變不同方向，每一點分別注射0.2 mL生理鹽水或EPCs懸液，共10點。注射中均可見室性期前收縮及短陣室速，注射停止則期前收縮消失。

1.4 梗死心肌組織內微血管計算 梗死區心肌石蠟包埋的組織切片采用CD34免疫組化染色。CD34定位于內皮細胞胞漿，顯示棕黃色或棕褐色，每份標本均選3個低倍視野（200×）、計數每個低倍視野的微血管數，取3個低倍視野微血管數為該份標本的平均微血管密度（MMVC）。

1.5 心肌梗死面積測量 移植后8周，開胸取出心臟，剪除雙側心房、右心室，沿左心室長軸由心尖到心底部做2 mm厚切片，共切5片。沖洗后，置于1%TTC溶液（以0.2M HCl，pH=7.8為緩沖液）中，37℃水浴箱中熱浴15 min后，顯示存活的心肌染成紅色，壞死心肌為白色。用TJTY-400型多媒體彩色病理圖文分析系統進行圖像分析，該系統自動測量出每層的心肌梗死面積占總面積的百分比。每層梗死心肌的容積=每層面積×厚度（2 mm），將5張切片中每層梗死心肌容積相加即為整個心肌的梗死面積（%）。

1.6 超聲心動圖心功能檢查 于細胞移植術1、2、4、8周后行超聲心動圖檢查，測量左心室射血分數(LVEF)。

2 結果

2.1 梗死區心肌微血管數量（血管密度）檢測 各個時段移植組梗死區血管密度明顯高于對照組，且隨著移植觀察時間的延長，血管密度逐漸增加。見表1。

表1 兩組梗死心肌血管密度比較 (±S) 個/視野

表1 兩組梗死心肌血管密度比較 (±S) 個/視野

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 1周 2周 4周 8周對照組 75.58±6.59 86.32±7.54 97.48±7.47 105.93±8.16內皮祖細91.13±8.65*111.65±13.76**129.87±15.31**141.46±15.86**胞移植組

2.2 心肌梗死面積測量 移植1、2、4、8周后梗死心肌面積明顯小于對照組（P＜0.01），且隨移植觀察時間的延長，梗死心肌面積逐漸減少。內皮祖細胞移植組梗死心肌瘢痕邊緣毛細血管密度明顯高于對照組。見表2。

表2 兩組心肌梗死面積的比較 (±S) cm2

表2 兩組心肌梗死面積的比較 (±S) cm2

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 1周 2周 4周 8周對照組 10.71±0.73 10.15±0.54 9.56±0.64 8.67±0.53內皮祖細胞移植組 9.90±0.93* 8.81±0.71* 7.76±0.63**6.55±0.68**

2.3 左室射血分數 應用超聲心動圖檢測心功能，內皮祖細胞移植組的左室射血分數較對照組明顯提高(P＜0.01)，且隨移植觀察時間的延長，左室射血分數逐漸升高。見表3。

表3 兩組LVEF比較 (±S)

表3 兩組LVEF比較 (±S)

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 1周 2周 4周 8周對照組 0.38±0.09 0.40±0.07 0.41±0.09 0.44±0.10內皮祖細胞移植組 0.39±0.11 0.43±0.08* 0.48±0.09**0.53±0.12**

3 討論

缺血性心臟病是臨床常見的疾病，盡管經皮冠狀動脈腔內成形術（PTCA）、冠狀動脈旁路移植術（CABG）、激光心肌血運重建術等已得到廣泛應用，但仍有部分患者不適合或無效，無法重建血運。近年來人們提出了血管形成(angiogenesis)治療方法來重建血運。治療性心肌血管新生(therapeutic angiogenesis)是指應用藥物、基因治療或其它治療手段刺激心肌缺血區小血管生長和側支循環形成，達到改善心肌缺血的目的[2]。這給冠心病，特別是不適宜PTCA、CABG,藥物治療效果又欠佳者帶來希望。促進血管新生是治療冠心病的理想方法，一般可通過以下四個途徑達到目的：（1）局部應用促血管新生的多肽生長因子；（2）轉染血管新生的基因；（3）開發心內膜的小通道，以增加從左室腔向心肌流向的血流通道；（4）局部血管應用干（祖）細胞[2～3]。

心血管疾病時血管新生主要發生在缺血性心血管病，此時其代償主要靠側枝循環的建立(collateral vessel recruitment)[4]。但是機體內源性側枝循環的代償是很有限的，極少能完全補償因血管閉塞而造成之血流量減少，因此近年出現了促血管新生治療或稱治療性血管新生[5～6]。本實驗顯示自體血管內皮祖細胞移植1、2、4、8周后梗死區血管密度高于對照組（P＜0.01），且隨移植觀察時間的延長，血管密度逐漸增加。移植1、2、4、8周后梗死心肌面積明顯小于對照組（P＜0.01），且隨移植觀察時間的延長，梗死心肌面積逐漸減少。內皮祖細胞移植組梗死心肌瘢痕邊緣毛細血管密度明顯高于對照組。內皮祖細胞移植組的左室射血分數較對照組明顯提高（P＜0.01），且隨移植觀察時間的延長，左室射血分數逐漸升高?？梢娮泽w血管內皮祖細胞移植到心肌梗死犬缺血心肌后能分化為毛細血管內皮細胞，促進梗死后心肌血管新生及心肌修復，改善心功能。

[1]Gill M,Dias S,Hattori K,et al.Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2(+)AC133(+)endothelial precursor cells[J].Circulation Research,2001,88:167-174

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[3]Beltrami AP,Barlucchi L,Torella D,et al.Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration[J].Cell,2003,114:763-776

[4]Freedman SB,Isner JM.Therapeutic angiogenesis for ischemic cardiovascular disease[J].J Mol Cell Cardiol,2001,33:379-393

[5]Tateishi-Yuyama E,Matsubara H,Murohara T,et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells:a pilot study and a randomised controlled trial[J].Lancet,2002,360:427-435

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