抗HIV-1 P24單克隆抗體純化方法的研究

王從印，張紅中，史希媛，蘇彥輝，王惠芬

（河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心生物室，河北石家莊 050017）

抗HIV-1 P24單克隆抗體純化方法的研究

王從印，張紅中，史希媛，蘇彥輝，王惠芬

（河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心生物室，河北石家莊 050017）

目的建立從小鼠腹水中純化抗人重組HIV-1 P24單克隆抗體的方法。方法含抗P24單克隆抗體的腹水經(jīng)離心、過濾及緩沖液變換等處理后，先經(jīng)鹽析處理，去除雜蛋白。再經(jīng)DEAE sepharose CL-6B、protein G親和層析柱進(jìn)一步純化。結(jié)果經(jīng)純化后獲得的抗P24單克隆抗體，其生物學(xué)活性、抗體效價(jià)保持良好，純度達(dá)到96.1%，抗體回收率達(dá)63.3%。結(jié)論建立的單克隆抗體純化方法簡便，高效，所得的單克隆抗體純度高，生物學(xué)活性好。

抗體，單克隆；獲得性免疫缺陷綜合征；方法；小鼠

艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由一種人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷為特征的傳染性疾病，目前仍然在全球范圍內(nèi)流行［1］。HIV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的靈長類慢病毒屬，有HIV-1、HIV-2兩種類型。我國以HIV-1為主要流行株［2］。P24是HIV-1的主要核心蛋白，是核殼組成蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼。即P24是HIV的核心抗原，含有較多的抗原決定簇，可以刺激宿主產(chǎn)生抗P24抗體。在HIV感染早期，抗體尚未出現(xiàn)之前即窗口期，P24抗原已經(jīng)存在，已有強(qiáng)傳染性。此時(shí)檢查HIV-1 P24可以更早發(fā)現(xiàn)艾滋病患者，提高艾滋病的檢出率，縮短窗口期，對于控制艾滋病的傳播，提早干預(yù)艾滋病患者，提高其生活質(zhì)量并延長其生命均具有重大的意義［3］，也是艾滋病治療的監(jiān)測手段之一。本文應(yīng)用硫酸銨粗提、DEAE sepharose CL-6B離子交換層析、protein G親和層析方法獲得了純度達(dá)96.1%的抗體，對于提高HIV-1 P24抗原檢測試劑盒的敏感性、特異性有重要意義，為P24抗原檢測試劑盒的制備奠定了基礎(chǔ)［4］。

1 材料與方法

1.1 材料：用本室自己研制的產(chǎn)生抗HIV-1 P24單克隆抗體的細(xì)胞株，注入小鼠腹腔，獲得小鼠腹水抗體（為Ig G1類免疫球蛋白）。DEAE sepharose CL-6B介質(zhì)amersham biosciences公司產(chǎn)品。Hitrap proteinG HP為瑞典GE hea1thcare公司產(chǎn)品。羊抗鼠IgG-HRP為美國KPL公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

HL-2恒流泵、HD 21C-B、紫外檢測儀、LM17型記錄儀、DBS-160電腦全自動部分收集器，上海康華生化儀器制造廠。752紫外光柵分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠。DYYⅢ23A垂直電泳儀，北京六一儀器廠。德國Heraeus離心機(jī)，凝膠成像系統(tǒng)，ZS-板式酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 腹水單克隆抗體的粗提：取20mL 12-G11腹水，加入等體積的PBS（0.01mo1/L，pH 7.4），脫脂棉過濾，離心15min（離心力11 000g），取上清液加入等量飽和硫酸銨，使溶液達(dá)到50%飽和度，于室溫下攪拌20min，4℃靜置2h，同上離心15min。棄上清，沉淀用適量PBS溶解，加飽和硫酸銨使溶液達(dá)到33%飽和度。棄上相，將沉淀用平衡緩沖液溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 離子交換層析法純化：層析柱內(nèi)徑2.2cm，柱高8cm，柱床體積30m L。DEAE sepharose CL-6B柱平衡緩沖液，0.05mo1/L Tris-HC1，0.05mo1/L NaC1，pH 8.5；DEAE sepharose CL-6B柱洗脫緩沖液，0.05mo1/L Tris-HC1，0.15 mo1/L NaC1，pH 8.5。在線清潔0.05mo1/L Tris-HC1，1mo1/L NaC1，pH 8.5。層析步驟，DEAE sepharose CL-6B層析柱經(jīng)平衡緩沖液平衡后上樣，然后分別用平衡緩沖液，洗脫緩沖液分別洗脫至基線。流速為1m L/min，收集蛋白峰。

1.2.3 Hitrap protein G HP柱親和層析：Hitrap protein G HP柱平衡緩沖液，20mmo1/L PB，pH 7.0；Hitrap protein G HP柱洗脫緩沖液，0.1mo1/L甘氨酸，pH 3.0。

層析步驟，含目的單抗的DEAE sepharose CL-6B柱洗脫樣品，經(jīng)Hitrap protein G HP柱平衡緩沖液透析，其間換液5次。Hitrap protein G HP柱經(jīng)平衡緩沖液平衡后上樣，然后分別用平衡緩沖液，洗脫緩沖液分別洗脫至檢測儀走至基線，流速為0.6mL/ min，收集蛋白峰。洗脫液洗脫時(shí)收集到的蛋白峰立即用0.1mo1/L Tris-HCL pH 9.0調(diào)節(jié)pH至7.0。用PBS pH 7.4透析過夜，采用PEG濃縮法將純化的樣品濃縮。20%乙醇流洗Hitrap protein G HP柱，4℃保存。

1.2.4 純化單抗特性鑒定：①SDS-PAGE電泳分析，各分離步驟樣品進(jìn)行12%還原SDS-PAGE電泳分析，按照公式計(jì)算蛋白濃度。蛋白濃度（g/L）=A280×1.45+A260×0.74×稀釋倍數(shù)。②利用凝膠成像系統(tǒng)Bandscan軟件分析各泳道純度，計(jì)算回收率。

2 結(jié) 果

2.1 DEAE離子交換層析法純化結(jié)果：粗提后的樣品經(jīng)DEAE sepharose CL-6B柱純化后，出現(xiàn)了3個(gè)蛋白峰（圖1），3峰之間分離度良好，達(dá)到了基線分離。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析可知，第2個(gè)蛋白峰為含有抗體組分的目的峰，純度為88.4%。

圖1 DEAE柱純化圖譜Figure 1 DEAE chromatographic profi1e

圖2 Protein G柱純化圖譜Figure 2 Protein G chromatographic profi1e

2.2 Hitrap protein G HP柱親和層析法純化結(jié)果：含目的蛋白的DEAE sepharose CL-6B柱純化組分，經(jīng)Hitrap protein G HP柱層析分離后出現(xiàn)了2個(gè)蛋白峰（圖2），2峰之間分離度良好，達(dá)到了基線分離。洗脫峰OD280峰值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于平衡緩沖液頂洗時(shí)的穿出峰。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析可知，洗脫峰即為所需要的單克隆抗體峰。

2.3 純化單抗的特性鑒定：由12%SDS-PAGE電泳（圖3）可知，腹水粗提后，經(jīng)DEAE離子交換層析純化，目的單抗獲得較良好的分離，單抗的純度為88.4%。經(jīng)過Hitrap protein G HP柱親和層析后，純化的IgG只有2個(gè)條帶，分子量分別是50KD、26KD，與理論值相符，且單克隆抗體純度達(dá)96.1%。腹水粗提，DEAE離子交換層析樣、proteinG親和層析純化樣經(jīng)蛋白濃度測定及電泳分析鑒定純度后，純度及回收率見表1。

Protein G親和柱第四次使用純化抗體純度達(dá)95.2%。見圖4。應(yīng)用間接ELISA法測定，粗提腹水蛋白效價(jià)為31.25mg/L，經(jīng)2步純化后，單克隆抗體效價(jià)達(dá)7.8mg/L。

表1 腹水經(jīng)各步分離純化后的蛋白純度及回收率比較Table1 Com parisons of purify and recovery ratio of the ascites Abs after each step of purification

圖3 12%還原SDS-PAGE電泳圖1.鹽析樣品；2.protein G柱純化樣品；3.DEAE柱純化樣品；4.低分子量蛋白質(zhì)Marker）Figure 3 12%reduced SDS-PAGE e1ectrophoretogram of the purified McAb1.a1tout McAb；2.mAb by DEAE chromatography；3.McAb by affinity chromatography；4.1ow mocu1ar weight Marker

圖4 Protein G親和柱第四次使用純化抗體效果圖1.低分子量蛋白質(zhì)Marker；2.Protein G柱第四次使用純化抗體樣品Figure 4 The profi1e ofMcAb purified by Protein G affinity co1umn used 4 times1.1ow mo1ecu1ar weight Marker 2.McAb purified by Protein G affinity used 4 times

3 討 論

目前，單克隆抗體已被廣泛應(yīng)用于疾病的診斷和治療等領(lǐng)域，因此制備純化出高純度高活性的抗體顯得尤為重要［5］。純化單克隆抗體的方法有很多種，其中親和層析法是純化抗體的主要途徑，該法操作簡便，產(chǎn)品純度高、得率高，但是有介質(zhì)價(jià)格昂貴等問題。

我們在研究中比較了proteinA、proteinG純化單抗的收率。發(fā)現(xiàn)proteinA與我們所制備的抗HIV-1 P24單抗結(jié)合很少，收率很低。而用proteinG柱純化則1mL介質(zhì)的柱可得到10mg單抗，因此我們選用了proteinG柱作為層析介質(zhì)。另外，我們發(fā)現(xiàn)proteinG柱上樣樣品經(jīng)過脫脂處理，可以增加proteinG柱的使用次數(shù)。

總之，本研究建立了一套純化單抗的方法，且分離純化抗體的純度達(dá)96.1%。為HIV-1 P24試劑盒的開發(fā)，敏感性的提高奠定了基礎(chǔ)［6］。

［1］程春林，范雁，吳士良，等.中國南方四省區(qū)流行的HIV-1 CRFO1-AE病毒株基因特征研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2009，30（1）：720-725.

［2］XIN RL，HE X，XING H，et a1.Genetic and tepora1 dynamics of human immunodeficiency virus type 1 CRF07-BC in Xinjiang. China［J］.JGen Viro1，2009，90（7）：1757-1761.

［3］ZHANG B，LIUD，BAO Z，eta1.High 1eve1so1ub1e expression，one -step purification and characterization of HIV-1 p24 protein［J］.J viro1，2011，22（8）：316.

［4］IDOYAGA J，LUBKIN A，F(xiàn)IORESE C，et a1.Comparab1e T he1per 1（Th1）and CD8 T-ce11 immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic ce11s within antibodies to Langerin，DEC205，and C1ec9A［J］.PNAS，2011，108（6）：2384-2389.

［5］KHEIRI F，SABZI RE，JANNATDOUST E，et a1.A nove1 amperometric immunosensor based on acetone-extracted propo1is for the detection of the HIV-1 p24 antigen［J］.Biosens Bioe1ectron，2011，26（11）：4457-4463.

［6］TANG SX，ZHAO JQ，WANG AF，et a1.Characterization of immune responses to capsid protein p24 of human immunodeficiency virus type 1 and imp1ications for detection［J］. C1in Vaccine Immuno1，2010，17（8）：1244-1251.

（本文編輯：趙麗潔）

DEVELOPMENT OF PURIFICATION FOR ANTI-HIV-1P24 MONOCLONAL ANTIBODY FROM M ICE ASCITES

WANG Congyin，ZHANG Hongzhong，SHIXiyuan，SU Yanhui，WANG Huifen
（The Laboratory of Biology，the Center of Biology，Medicine and Technology，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China）

Ob jective To deve1op amethod for purification of anti-rhHIV-1 P24 monoc1ona1 antibody（mAb）from mice ascites.MethodsThe ascites was first purified by saturated ammonium su1fate after centrifugation and fi1tration.Then the fraction containing the protein of interest was direct1y purified by affinity chromatography with Protein G sepharose.Resu lts The purity of the obtained mAb was up to 96.1%and recovery of 63.3%with high activity.ConclusionThemethod for purification of mAb is simp1e and effective and the obtained mAbs are of high purity and activity.

antibodies，monoc1ona1；acquired immunodeficiency syndrome；Methods；mice

R512.91

A

1007-3205（2011）10-1127-03

2011-05-31；

2011-07-21

王從印（1971-），女，河北無極人，河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心主管檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2011.10.005