氫醌抑制HL-60細胞分化上調過氧化物酶2-Cys過氧化物氧還蛋白表達

韋瀟湘，唐 深，王春雙，陳長艷，陸彩玲，郭松超，李習藝

(廣西醫(yī)科大學1.公共衛(wèi)生學院;2.基礎醫(yī)學院;廣西南寧 530021)

氫醌(hydroquinone，HQ)又名對苯二酚［C6H(OH)］，是苯在生物體內的代謝產物，在苯血液毒性中發(fā)揮重要的作用，可導致再生障礙性貧血、骨髓異常增生綜合征、白血病及淋巴瘤等多種造血系統(tǒng)功能障礙，研究HQ血液毒性機制對探討苯的毒性機制具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，在人胚肺成纖維細胞MRC-5及人臍血單個核細胞中，HQ的毒性可能與過氧化物酶2-Cys過氧化物氧還蛋白(peroxiredoxins)(2-Cys Prxs)有關［1－2］。2-Cys Prxs是細胞內一類抗氧化蛋白家族，它們都有兩個高度保守的具有氧化還原活性的半胱氨酸殘基，即過氧化活性的胱氨酸殘基cys51和還原活性的半胱氨酸殘基cys172。2-Cys Prxs在氧化應激中發(fā)揮重要的作用［3］，保護細胞免受氧自由基損害，同時它們在細胞增殖與分化中也起著重要的作用［4］。HL-60細胞株是人前髓細胞株，其髓系祖細胞特性明顯，具有多向分化能力，在豆蔻酰佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)或二甲亞砜(DMSO)誘導下可分別向單核系或粒系分化，適用于粒系、單核系分化研究［5－6］。本實驗主要研究HQ對HL-60細胞向單核系、粒系分化的影響，并探討2-Cys Prxs在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

HL-60細胞購自上海細胞生物所，IMDM培養(yǎng)基購自美國海克隆實驗室公司，PMA和HQ購自Sigma公司，硝基四氮唑藍(NBT)購自Sanland公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)、顯影定影試劑盒購自碧云天生物技術研究所。cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒與熒光定量 PCR引物購自沈陽TaKaRa公司;Trizol購自美國 Invitrogen公司，Western印跡抗體購自Santa Cruz公司及Fermantas公司，其余試劑為國產分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

HL-60細胞培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)基，含胎牛血淸200 ml·L－1，青霉素 100 kU·L－1，鏈霉素 100 mg·L－1。在37℃，含體積分數為0.05 CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)傳代。

1.3 HL-60 細胞染毒

根據前期實驗結果及文獻［2，5－6］，細胞分為正常對照組、PMA 20 nmol·L－1、PMA 20 nmol·L－1+HQ 1，5 和50 μmol·L－1，以及 1.25%DMSO對照、DMSO+HQ 1，5 和 50 μmol·L－1組，各組細胞數為1×109L－1。HQ用前用無血清IMDM配制，正常對照組加入相應體積無血清IMDM。分別在48和96 h收集細胞。

1.4 細胞形態(tài)學觀察

取各個實驗組的HL-60細胞懸液5 μl推片晾干，乙醇 50 ml·L－1固定 5 min，乙醇 80 ml·L－1固定5 min后晾干，瑞氏-姬姆薩染液染色5～10 min沖洗晾干，光鏡下觀察。

1.5 NBT還原酶檢測HL-60細胞分化

收集各個實驗組的HL-60細胞，錐蟲(臺盼)藍檢測細胞活力，取200 μl含有1×1 O5個活細胞的細胞懸液，加入200 μl 1%NBT 溶液含終濃度為2 mg·L－1的佛波酯(PMA)混合，放入37℃孵育60 min，再將細胞離心后去除上清液，每份標本加入200 μl DMSO，在室溫下振蕩20 min，測波長570 nm的吸光度值(absorbance，A)［7－8］。A 值越大表明細胞分化程度越佳。

1.6 HL-60細胞增殖檢測

參照CCK-8試劑說明書收集各組HL-60細胞，棄原培養(yǎng)液，每組細胞加入含 CCK-8 100 ml·L－1的培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，測定A450nm。

1.7 熒光定量PCR檢測2-Cys Prxs基因表達

1.7.1 總 RNA 制備

離心收集各實驗組的細胞，棄培養(yǎng)液，加入1 ml Trizol，室溫放置 10 min，加 0.2 ml氯仿，振蕩 15 s，靜置3 min，4℃，12 000×g離心15 min，取水相加入0.5 ml異丙醇，室溫放置10 min，4℃，12 000 ×g離心10 min，75%乙醇洗滌干燥后溶于純焦碳酸二乙酯，紫外分光光度儀檢測提取總RNA的質量和濃度。要求A260/A280在1.8～2.1范圍，并計算 RNA含量。

1.7.2 cDNA 的合成

反應體系 20 μl，取隨機引物(100 μmol·L－1)1 μl，每一份標本取總 RNA 1 μg，RNA 酶抑制劑(40 kU·L－1)0.5 μl，dNTP 混合物 (各 10 μmol·L－1)1 μl，5 倍反應緩沖液4 μl，逆轉錄酶100 U，加純焦碳酸二乙酯至 20 μl。按 42℃ 30 min，95℃ 2 min，進行逆轉錄。合成好的cDNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.3 實時熒光定量 PCR檢測2-Cys Prxs基因表達

20 μl反應體系中包括:上下游引物 10 μmol·L－1各 0.8 μl，SYBR ? Premix Ex TaqTM(2 × )10 μl，ROX Reference DyeⅡ(50 × )0.4 μl，雙蒸水 7 μl，cDNA標本1 μl。各基因擴增片段長度如下:PrxⅠ為141 bp，PrxⅡ為129 bp，PrxⅢ為98bp，PrxⅣ為75 bp，引物序列見表 1。按 95℃，30 s;40個循環(huán)(95℃，5 s;60℃，34 s)進行反應，反應結束后，儀器自動記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環(huán)數(threshold cycles，Ct)值。以β肌動蛋白基因為內參，采用雙ΔCt法計算目的基因表達量，每個樣品目的基因表達量除以內參基因β肌動蛋白表達量即為樣品基因相對含量［8］。以2－(實驗組ΔCt－對照組ΔCt)表示實驗組目的基因相對于正常對照組表達的變化倍數。其中實驗組ΔCt和對照組ΔCt分別是實驗組和對照組目的基因與內參基因β肌動蛋白的Ct的差值。

表1 過氧化物氧還蛋白(Prx)Ⅰ，PrxⅡ，PrxⅢ，PrxⅣ及β肌動蛋白引物序列Tab.1 Primer of peroxiredoxin(Prx)Ⅰ，PrxⅡ，PrxⅢ，PrxⅣand β-actin in real time PCR

1.8 Western印跡法檢測PrxⅢ蛋白的表達

各實驗組細胞用Trizol抽提RNA的同時抽提總蛋白，用Bradford法定量蛋白，調整總蛋白上樣量，以β肌動蛋白為內參照。SDS-PAGE電泳后，0.1 A恒流轉膜35 min;5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，在暗房進行化學發(fā)光試劑染膜后顯影成像。以目標條帶與β肌動蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)的比值定量蛋白表達。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 氫醌對HL-60細胞形態(tài)的影響

圖1染色結果顯示，正常對照組細胞胞體較大，胞核大而圓，胞質堿深染，核質比例大。DMSO，HQ+DMSO組可見細胞胞體明顯縮小，胞核凹陷，核質比例縮小，桿狀核、分葉核細胞增多，細胞趨于向成熟粒系分化。PMA和HQ+PMA組可見部分細胞易貼壁，細胞核漿比例變小，核形狀不規(guī)則，有明顯的扭曲或折疊，呈腎形或U形、馬蹄形等，呈現(xiàn)向單核或巨噬細胞分化的特征。

圖1 氫醌(HQ)對HL-60細胞形態(tài)的影響 (瑞氏-姬姆薩染色 ×400).A:正常對照細胞，箭頭示細胞胞核大而圓;B:豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)處理細胞48 h后，箭頭示U形細胞;C:1.25%二甲亞砜(DMSO)處理細胞96 h后，箭頭示多葉核細胞;D:PMA+HQ 50 μmol·L－1處理細胞48 h后，箭頭示不規(guī)則核細胞;E:DMSO+HQ 5 μmol·L－1處理細胞96 h后，箭頭示細胞胞核凹陷;F:DMSO+HQ 50 μmol·L－1處理細胞96 h后，箭頭示多葉核細胞.Fig.1 Effect of hydroquinone(HQ)on morphological changes in HL-60 cells(Wright Giemsa ×400).

2.2 氫醌對HL-60細胞分化的影響

表2所示各實驗組的HL-60細胞對NBT還原力。與正常對照組比較，PMA組和DMSO組HL-60細胞NBT還原力明顯增加(P＜0.05)，說明PMA和DMSO可分別誘導HL-60細胞向單核細胞和粒細胞分化。與PMA和DMSO對照組比較，PMA+HQ和DMSO+HQ各組細胞對NBT還原力均下降，PMA+HQ 5 和 50 μmol·L－1組與 PMA 組比較有明顯差異(P ＜0.05)，說明 HQ 1 和5 μmol·L－1可以抑制 HL-60 細胞向單核系分化;DMSO+HQ 50 μmol·L－1組和DMSO對照組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明HQ 50 μmol·L－1可抑制細胞向粒系分化。

表2 氫醌對HL-60細胞分化的影響Tab.2 Effect of HQ on differentiation of HL-60 cells

2.3 氫醌對HL-60細胞增殖的影響

如表 3 所示，HQ 50 μmol·L－1+PMA 作用于HL-60細胞后，細胞CCK-8還原值與單獨PMA組比較明顯下降;HQ 5，50 μmol·L－1+DMSO 組細胞CCK-8的還原值與單獨DMSO組比較明顯下降。這表明 HQ 5 和 50 μmol·L－1與誘導劑的共同作用可以抑制HL-60細胞增殖。

表3 氫醌對HL-60細胞增殖的影響Tab.3 Effect of HQ on proliferation of HL-60 cells

2.4 氫醌對HL-60細胞2-Cys Prxs基因表達的影響

總RNA凝膠電泳后，28 s亮度明顯強于18 s，5 s很弱，說明RNA完整性較好(圖2)，分光光度計測A260/A280在1.8～2.1。各目的基因在 HL-60 細胞表達相對定量檢測結果顯示，PrxⅠ～PrxⅣ各引物融解曲線均呈清晰的單一峰型，說明設計的引物擴增出的擴增產物沒有非特異性擴增，引物可用。各基因表達Ct值在16～24，各基因的相對表達量在0.15～2。與正常對照組比較，PMA組2-Cys Prxs基因表達水平均有降低的趨勢，PrxⅢ的表達水平與正常對照組比較有明顯差異(P＜0.05);DMSO組的2-Cys Prxs基因表達水平顯著降低(P＜0.01)。給予 HQ 刺激后，在PMA+HQ 5 μmol·L－1組，PrxⅢ，PrxⅣ的表達高于對照組(P＜0.01)，在PMA+HQ 50 μmol·L－1組，PrxⅠ，PrxⅢ，PrxⅣ的表達水平與正常對照組和PMA組相比明顯增高(P＜0.01)。PrxⅡ在各處理組的表達水平低于對照組，但沒有統(tǒng)計學意義。而隨著 HQ 濃度的增加，只有 HQ 50 μmol·L－1+DMSO組PrxⅠ，PrxⅢ的表達水平與DMSO組相比明顯增高(P ＜0.01)，HQ 5 μmol·L－1+1.25%DMSO各組與單獨DMSO組比較，2-Cys Prxs各基因表達水平的差別沒有統(tǒng)計學意義(表4，表5)。

圖2HQ作用HL-60細胞后的核蛋白體RNA瓊脂糖凝膠電泳圖.M:標志物;條帶1～5:分別為正常對照，PMA，PMA+HQ1，5 和50 μmol·L－1組.Fig.2 RNA agarose gel electrophoresis of HL-60 cells affected by HQ.

表4 HQ對PMA誘導的HL-60細胞向單核系分化過程中過氧化物酶2-Cys過氧化物氧還蛋白(2-Cys Prx)基因表達的影響Tab.4 Effect of HQ on expression of 2-Cys peroxiredoxins(2-Cys Prxs)in HL-60 cells during monocytic differentiation induced by PMA

表5 HQ對DMSO誘導的HL-60細胞向粒系分化過程中2-Cys Prxs基因表達的影響Tab.5 Effect of HQ on expression of 2-Cys Prxs in HL-60 cells during granulocytes differentiation induced by DMSO

2.5 氫醌對HL-60細胞PrxⅢ蛋白表達的影響

如圖3和圖4所示，PMA對照組和DMSO對照組PrxⅢ蛋白表達水平均低于正常對照組。在PMA誘導分化的實驗組中，給予HQ共同處理后，各組PrxⅢ蛋白表達量有顯著增加的趨勢(P＜0.01)。在DMSO誘導分化的實驗組中，只有在HQ 50 μmol·L－1+DMSO組PrxⅢ表達量明顯高于DMSO對照組(P＜0.01)但低于正常對照組(P＜0.05)。蛋白免疫印跡結果與熒光定量PCR結果是一致的，說明PrxⅢmRNA表達水平變化和蛋白表達水平的變化是一致的。

圖3HQ對PMA誘導的HL-60細胞向單核系分化過程中PrxⅢ蛋白表達的影響.A:Western印跡;B:半定量結果.1～5分別為正常對照，PMA對照，PMA+HQ 1，5和50 μmol·L－1組.±s，n=6.*P＜0.05，與正常對照組比較;##P＜0.01，與PMA對照組比較.Fig.3 Effect of HQ on expression of PrxⅢ protein in HL-60 cells during monocytic differentiation induced by PMA detected by Western blotting.

圖4HQ對1.25%DMSO誘導的HL-60細胞向粒系分化過程中PrxⅢ蛋白表達的影響.A:Western印跡;B:半定量結果.1～5分別為正常對照，DMSO對照，DMSO+HQ 1，5和50 μmol·L－1組.±s，n=6.*P＜0.05，與正常對照組比較;##P＜0.01，與DMSO組比較.Fig.4 Effect of HQ on expression of PrxⅢ protein in HL-60 cells during grannlocytes differentiation induced by 1.25%DMSO detected by Western blotting.

3 討論

本研究結果顯示，HQ作用后，PMA誘導HL-60細胞向單核系分化受到抑制，與Oliveira等［7］所報道的一致。但關于HQ對HL-60細胞向粒系分化的影響，Oliverira［7］與 Hedli等［9］報道不一，可能是由于HQ劑量不同所致。而在本實驗中，HQ 1 μmol·L－1對粒系分化無影響，但較高劑量HQ可抑制細胞向粒系分化，這些結果提示細胞向單核系分化較向粒系分化對HQ所引起的細胞毒性作用更為敏感。在本實驗中也發(fā)現(xiàn)，較高劑量HQ抑制分化的同時伴隨細胞增殖的抑制，說明一定劑量HQ可以影響細胞的分化與增殖，它可能就是通過這種途徑而發(fā)揮其在血液系統(tǒng)中的毒性作用。

本研究結果顯示，PrxⅠ，PrxⅢ和PrxⅣ與HQ對HL-60細胞分化和增殖抑制的生物學效應有關。其中PrxⅢ在所有分化抑制的細胞組表達顯著增高，而在分化未受到抑制的組未見誘導表達，提示其在HQ抑制分化過程中扮演重要角色。但在本次實驗中，未能用RNAi技術抑制PrxⅢmRNA表達來進一步觀察PrxⅢ是否真正地參與HQ抑制HL-60細胞分化的過程，因此還不能說明PrxⅢ與此過程有真正的因果關系，這在后續(xù)的實驗中會繼續(xù)研究。PRXⅢ定位于線粒體，在線粒體抗氧化防御機制中起著重要作用，并且參與細胞的增殖、分化、轉化和凋亡等活動［10－11］。Yang 等［10］研究表明 PrxⅢ與紅細胞的分化有關，Wonsey等［11］也發(fā)現(xiàn)PrxⅢ是Myc的靶基因，參與Myc介導的增殖、凋亡和腫瘤轉化。但PrxⅢ在粒系分化中的作用如何尚未見報道，其在HQ對HL-60細胞分化影響過程中的具體作用及機制如何，其表達水平的變化是分化的原因還是結果等問題都還有待進一步研究。

［1］ Li X，Tang S，Huang H，Yang L，Liu J，Zhuang Z.Induction of a cell-survival adaptive response in MRC-5 cells by hydroquinone［J］.Mutat Res，2008，652(2):180-185.

［2］ 唐 深，李習藝，陸彩玲，曾曉春，肖德強，孫 斌，等.氫醌刺激臍血單個核細胞適應性反應基因表達［J］.中國公共衛(wèi)生，2009，25(11):1339-1340.

［3］ Fujii J，Ikeda Y.Advances in our understanding of peroxiredoxin，a multifunctional，mammalian redox protein［J］.Redox Rep，2002，7(3):123-130.

［4］ Butterfield LH，Merino A，Golub SH，Shau H.From cytoprotection to tumor suppression:the multifactorial role of peroxiredoxins［J］.Antioxid Redox Signal，1999，1(4):385-402.

［5］ Zheng X，Ravatn R，Lin Y，Shih WC，Rabson A，Strair R，et al.Gene expression of TPA induced differentiation in HL-60 cells by DNA microarray analysis［J］.Nucleic Acids Res，2002，30(20):4489-4499.

［6］ Saegusa S，Totsuka M，Kaminogawa S，Hosoi T.Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans stimulate cytokine secretion from human neutrophil-like HL-60 cells differentiated with retinoic acid or dimethylsulfoxide［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(12):2600-2608.

［7］ Oliveira NL，Kalf GF.Induced differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells to monocyte/macrophages is inhibited by hydroquinone，a hematotoxic metabolite of benzene［J］.Blood，1992，79(3):627-633.

［8］ Li D，Wang Z，Chen H，Wang J，Zheng Q，Shang J，et al.Isoliquiritigenin induces monocytic differentiation of HL-60 cells［J］.Free Radic Biol Med，2009，46(6):731-736.

［9］ Hedli CC，Rao NR，Reuhl KR，Witmer CM，Snyder R.Effects of benzene metabolite treatment on granulocytic differentiation and DNA adduct formation in HL-60 cells［J］.Arch Toxicol，1996，70(3-4):135-144.

［10］ Yang HY， Jeong DK， Kim SH， Chung KJ，Cho EJ，Yang U，et al.The role of peroxiredoxinⅢ on late stage of proerythrocyte differentiation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359(4):1030-1036.

［11］ Wonsey DR， Zeller KI， Dang CV. The c-Myc target gene PRDX3 is required for mitochondrial homeostasis and neoplastic transformation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(10):6649-6654.