腦內注射納米三氧化二鐵對大鼠空間學習記憶功能的影響及對腹側中腦的損傷作用

劉袁靜，李 濤，曾水林，王健華，史婷婷，朱建寶

(東南大學醫學院人體解剖學與組織胚胎學系，江蘇南京 210009)

近年來研究證實，納米顆粒可以通過呼吸道吸入、胃腸道吸收、皮膚組織的滲透、注射等途徑進入循環系統，通過循環系統進入各組織而產生影響［1］。由于納米顆粒的特殊性質，直徑較小的顆粒可通過血腦屏障，顆粒尺寸越小進入腦的量越多，越容易進入較深的腦區，產生的損傷越嚴重［2］。動物實驗顯示，納米顆粒對心、肺、肝和脾等器官有不同程度的毒性損害作用［3］。納米三氧化二鐵(ferric oxide nanoparticles，nano-Fe2O3)擬作為影像學診斷標記物和藥物治療載體用于臨床，藥物釋放后剩余的nano-Fe2O3顆粒載體不能被很快地代謝，在中樞神經系統(central nervous system，CNS)的積累對神經系統，尤其對腦有毒性作用值得研究。Ben-Shachar等［4］、陳先文等［5］及姜宏等［6］分別將FeCl3直接注射入大鼠黑質內，觀察到高濃度FeCl3對黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經元有損傷作用，并導致類似帕金森病(Parkinson's disease，PD)樣自主運動功能障礙。據報道［4，7］，部分PD患者和PD動物模型有學習記憶等認知功能障礙。本實驗將nano-Fe2O3注入大鼠腹側中腦，觀察nano-Fe2O3對動物學習記憶功能的影響和腹側中腦組織的形態學變化，為nano-Fe2O3應用于臨床的安全性評價，提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

nano-Fe2O3由東南大學納米技術研究中心實驗室制備，直徑10 nm，濃度20 g·L－1;小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體(美國Sigma公司);兔抗大鼠膠質纖絲酸性蛋白質(GFAP)多克隆抗體(美國Sigma公司);小鼠抗大鼠OX-42單克隆抗體(英國AbD Serotec公司);通用型過氧化物酶標記的鏈酶卵白素(SP-9000)免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，濃縮DAB顯色試劑盒(ZLI-9032)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

江灣Ⅱ型立體定位儀(第二軍醫大學)，大鼠Morris水迷宮(上海移數信息科技有限公司Morris水迷宮及視頻系統RD1101-MM)，CM-1900冰凍切片機(德國Leica公司)和Olympus光學顯微鏡(日本Olympus公司)，Leica圖像處理系統(德國Leica公司)。

1.2 動物及分組處理

健康成年SD大鼠42只，♂，體質量200～250 g，由東南大學實驗動物中心提供〔實驗動物使用許可證號:SYSK(蘇)2010-0004〕。按照Morris水迷宮實驗要求，篩選出符合標準的36只，隨機分為6組，每組6只，分別為正常對照組，溶劑(生理鹽水)組，nano-Fe2O3后1，2，3和4周取樣組。除正常對照組大鼠外，其余大鼠ip 給予0.4%戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)麻醉后，固定于立體定位儀上，常規消毒，開顱，暴露前囟，參照Paxinos-Watson大鼠圖譜，注射靶點為中腦黒質(substantia nigra，SN)和腹側被蓋區(ventral tegmental area，VTA)，SN 注射點坐標(mm)為AP:－4.8;ML:1.8;DV:9.2;VTA 注射點坐標(mm)為 AP:－4.8;ML:1.0;DV:9.2。nano-Fe2O3組與溶劑對照組在腦立體定位下各一次性注射1 μl nano-Fe2O320 g·L－1或生理鹽水，注射速度 0.2 μl·min－1。注射完畢，留針 10 min，提針 0.5 mm 后，再留針1 min，然后按 2.0 mm·min－1速度緩慢拔針。術后大鼠包被保暖，清醒后置籠喂養。分別于藥后1，2，3和4周行Morris水迷宮實驗，灌流取腦行Perls反應和免疫組織化學染色。

1.3 Morris水迷宮實驗測定大鼠學習記憶能力

Morris水迷宮直徑160 cm、水深30 cm、站臺直徑11 cm、高28 cm。將Morris水迷宮以水池邊緣相等分布的4個點作為入水點，將圓形水池等分為4個象限，平臺位于第四象限內，在水面下2 cm。水中加入墨汁以使水不透明，保持水溫在(25±1)℃，水迷宮外視覺線索相對固定。

隨機選擇入水點(即第一象限)，按逆時針方向，將大鼠從各象限邊緣中點位置面向池壁放入水中，允許大鼠用300 s找到隱藏在水下的逃避平臺，找到平臺后允許在平臺上停留10 s，如果在規定時間內找不到平臺，實驗者幫助其找到平臺并允許在平臺上停留10 s，之后再進行下一次訓練，每天連續訓練4次，將4次的算術平均值記為當天的成績，持續訓練4 d。

在制作動物模型前測試，測試時任選一個入水點(即第二象限)將大鼠面向池壁放入水中，記錄180 s內在目標象限(即第四象限)運動時間。藥后1，2，3和4周用相同的方法進行Morris水迷宮檢測。實時監控，并記錄找到平臺時間、游泳距離、游泳速度、潛伏期和搜索平臺策略。

1.4 Perls反應法與免疫組織化學染色檢測nano-Fe2O3對大鼠腹側大腦的損傷

各組實驗動物在行Morris水迷宮測試后，ip給予0.4%戊巴比妥鈉，于深度麻醉下心臟灌注肝素化生理鹽水250 ml，繼續灌注4%多聚甲醛400 ml。取全腦置于4%多聚甲醛溶液后固定24 h，入30%蔗糖溶液至沉底。取中腦行冰凍連續冠狀切片，片厚30 μm。分 3 份分別行 TH+/鐵+、GFAP+/鐵+、OX-42+/鐵+免疫組化染色［8］。

1.4.1 Perls反應法(普魯士藍反應)

在Perls液(20%亞鐵氰化鉀水溶液25 ml，2%鹽酸水溶液25 ml。兩液分別配制貯存，臨用前等量混合，過濾后使用)中反應20～30 min，蒸餾水充分漂洗終止反應。

1.4.2 免疫組化(SP法)

Perls反應后的切片用 PBS 0.01 mol·L－1(pH 7.4)沖洗5 min，加3%H2O2去離子水反應15 min，PBS洗5 min×3次，加10%山羊血清37℃反應30 min封閉(不洗)，再加小鼠抗大鼠 TH抗體(1∶10 000)或兔抗大鼠 GFAP 抗體(1∶80)4℃ 過夜，或小鼠抗大鼠OX-42抗體(1∶200)4℃ 48 h。用PBS洗5 min×3次，加生物素化二抗 (1∶100)37℃60 min，PBS洗5 min×3次，加入過氧化物酶復合物(1∶100)37℃ 30 min，PBS洗5 min×3 次，后用DAB顯色，蒸餾水終止反應，在PBS中貼片，干燥后脫水、透明、封片。另外任取一張切片作陰性對照，用正常羊血清代替一抗，結果為陰性。每個獨立組收集數據的樣本數為4，每個樣本取腹側中腦黒質區相同序列切片6張，在200倍光鏡下隨機計數10個非重疊視野分別計數 TH+/鐵+、GFAP+/鐵+、OX-42+/鐵+細胞數，TH+、GFAP+和 OX-42+單標細胞數，采用DP Controller進行圖像分析，計數陽性細胞，并照相。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0分析軟件進行統計分析，計量數據結果以±s表示，各組間結果比較采用配對t檢驗進行方差分析;搜索平臺策略采用構成比進行比較。

2 結果

2.1 腦內注射納米三氧化二鐵對大鼠學習記憶的影響

表1結果顯示，與正常對照組比較，溶劑對照組各項指標沒有明顯差異，說明生理鹽水對大鼠的學習記憶功能無影響。nano-Fe2O3后1～4周游泳速度明顯變慢(P＜0.05);藥后2和3周找到平臺時間和潛伏期明顯變長(P＜0.05);nano-Fe2O3藥后游泳距離隨時間的增加呈下降趨勢，但無統計學差異。

表1 腦內注射納米三氧化二鐵對大鼠空間學習記憶的影響Tab.1 Effect of intracerebral injection of nano-Fe2O3on the spatial learning and memory in rats

搜尋平臺策略結果顯示，正常對照組以趨向式為主(4/6)，生理鹽水組以趨向式(3/6)和隨機式軌跡為主(3/6)，藥后1周以隨機式(3/6)和邊緣式(2/6)，藥后2周以隨機式(2/6)和邊緣式(4/6)為主，藥后3周以隨機式(3/6)和邊緣式(3/6)為主，藥后4周以隨機式為主(5/6)。

2.2 腦內注射納米三氧化二鐵對大鼠腹側中腦的損傷作用

Perls反應與免疫組化染色結果顯示，注射生理鹽水大鼠腦黑質可見大量TH+細胞，細胞形態飽滿清晰，胞漿內未見有nano-Fe2O3顆粒，TH+纖維密集，交織成網(圖1A);而nano-Fe2O3組TH+細胞明顯減少，在殘存的TH+細胞胞漿內可見nano-Fe2O3顆粒沉積，即TH+/鐵+雙標細胞(圖1B中箭頭指示)，TH+纖維稀少，排列紊亂(圖1D);正常對照組僅見GFAP+，OX-42+單標細胞，細胞形態規則，數量較少，OX-42+單標細胞呈散在分布(圖1C，E)，nano-Fe2O3組可見大量 GFAP+/鐵+和 OX-42+/鐵+雙標細胞(圖1D，F中箭頭指示)，細胞形態不規則，胞漿內有吞噬的nano-Fe2O3顆粒，突起粗而短，整個細胞呈反應性增大，細胞數量明顯增加。

圖1 Perls反應法與免疫組化 DAB顯色檢測腦內注射納米三氧化二鐵對大鼠腹側中腦的損傷作用 (×400).A，C和E分別為正常對照組的 TH+/鐵+、GFAP+/鐵+和 OX-42+/鐵+染色結果;B，D和F分別為 nano-Fe2O3組的 TH+/鐵+、GFAP+/鐵+和OX-42+/鐵+染色.Fig.1 Effect of intracerebral injection of nano-Fe2O3on ventral midbrain injury by Perls reaction and immunohistochemical reaction(×400).

表2 大鼠腹側中腦注射納米三氧化二鐵對TH+、GFAP+和OX-42+陽性細胞數的影響Tab.2 Effect of ventral midbrain injection of nano-Fe2O3 on positive cell numbers of TH+，GFAP+and OX-42+in rats

注射nano-Fe2O3藥后1～4周，大鼠中腦黑質TH+/鐵+、GFAP+/鐵+、OX-42+/鐵+雙標細胞數量沒有明顯統計學差異(數據未提供)。表2結果顯示，與正常對照組相比，注射生理鹽水對TH+、GFAP+和OX-42+單標細胞數量無統計學差異，注射nano-Fe2O3藥后1～4周TH+細胞數量顯著降低(P＜0.05)，GFAP+和OX-42+單標細胞數量顯著增加(P ＜0.01)。

3 討論

Morris水迷宮研究結果發現:nano-Fe2O3組藥后2和3周找到平臺時間和潛伏期變長;搜索平臺策略，正常對照和生理鹽水組以趨向式和隨機式為主，nano-Fe2O3組用藥后以隨機式和邊緣式為主，說明nano-Fe2O3損傷中腦腹側DA能神經元，影響到與認知功能密切相關的海馬、大腦皮質額葉及其環路，引起認知功能障礙。已有證據顯示［7，9］，額前皮質在學習記憶中起關鍵作用，而大多數到達前額葉皮質的DA能傳出神經發自VTA，部分發自SN，前額葉皮質通過發自于SN的DA能投射調節皮質-基底節環路處理記憶信息。本實驗藥后1周和4周與正常對照組無顯著差異可能與藥物濃度及時間和小膠質細胞對納米鐵的清除及星形膠質細胞對局部損傷的修復有關［10－11］。nano-Fe2O3組藥后各組游泳速度均慢于正常對照組，可能與nano-Fe2O3對SN和VTA區DA能神經元的損傷作用有關，與臨床上PD患者出現運動遲緩、肌肉僵直和震顫等癥狀有一定的相似性。

本實驗結果顯示，腦內注射nano-Fe2O3破壞黒質DA能神經元，刺激膠質細胞數目增加，膠質細胞通過吞噬nano-Fe2O3顆粒而限制其在組織中蓄積。據報道［11］，在損傷前期，膠質細胞通過吞噬異物、分泌營養因子、通過自身的抗氧化應激作用、對神經毒物的清除等而發揮保護作用;在損傷后期，激活的膠質細胞可產生炎癥和神經毒性因子，以不同途徑啟動細胞內某些信號轉導通路，最終導致DA能神經元的損傷。姜宏等［6］實驗結果已證實，黑質內的鐵和尾狀核DA含量之間有直接關系，即鐵增加后，尾狀核的DA含量顯著減少。nano-Fe2O3組大鼠黑質區TH+細胞內有鐵顆粒沉積及對DA能神經元的損傷作用，與陳先文等［5］的報道是一致的。本實驗研究結果表明，膠質細胞在nano-Fe2O3注射后數量就大量增加，TH+細胞數量在藥后1周減少不顯著與膠質細胞在損傷前期的保護作用有一定的相關性，在藥后2和3周減少非常顯著與損傷后期產生的炎癥和神經毒性因子促使DA能神經元損傷有關。星形膠質細胞在PD中起雙重作用［12］，一方面星形膠質細胞可能通過分泌神經元所需的神經營養因子和細胞因子以及合成單胺類氧化酶等發揮神經保護作用;另一方面在刺激因子作用下活化的星形膠質細胞可能通過釋放炎癥因子、氧自由基、影響谷氨酸和自由鐵的代謝等促進PD的發生發展。因此，膠質細胞在大鼠DA能神經元損傷方面起著雙重作用。

本實驗結果顯示，腦內注射nano-Fe2O3后損傷了SN和VTA，可導致動物的空間學習記憶功能障礙，引起DA能神經元的破壞及膠質細胞數目和形態的改變。Kircher等［13］用(280 ± 80)nm的Fe2O3通過鼻吸的方法證實，海馬的神經元細胞發生脂肪變性，說明吸入小顆粒的nano-Fe2O3可以對CNS產生毒性作用。汪冰等［14］用(280 ±80)nm和21 nm的Fe2O3通過鼻腔滴注的方法證實納米顆粒可以滲透到大腦的深部，并且觀察到有破壞海馬細胞形態的潛能，也可進入腦干和中腦等較深腦區。nano-Fe2O3擬作為藥物診療常用載體或經常在nano-Fe2O3顆粒環境中工作，其對神經系統的影響不容忽視，長期大劑量接觸或使用nano-Fe2O3應考慮安全性。關于不同粒徑的nano-Fe2O3顆粒經不同途徑進入人體對神經系統的毒性作用尤其是對中腦的損傷作用及其機制尚需做進一步的研究。

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