cAMP-PKA信號通路對L02細胞藥物代謝酶CYP3A的調控作用

李 敏，張 冰，劉小青

(1.陜西中醫學院藥學院，陜西咸陽 712046;2.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

肝是機體藥物代謝的主要器官，大多數藥物都要經過肝代謝酶作用發揮效應，其中細胞色素P4503A(cytochrome P4503A，CYP3A)是最主要的藥物代謝酶。CYP3A的活性直接影響藥物對機體的治療作用及毒性反應［1］。CYP3A表達主要通過核受體孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)調控［2］。cAMP-PKA信號通路介導體內多種信號傳導，該信號通路可能調節 CYP3A 的表達［3］。8-Br-cAMP和 H-89 分別是cAMP-PKA信號通路的激動劑和抑制劑，本實驗研究8-Br-cAMP及H-89作用于L02細胞，觀察CYP3A的變化，研究CYP3A的表達機制，探討該信號通路對藥物代謝酶的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

L02細胞由北京中醫藥大學中藥學院生物技術系王春梅老師惠贈。錐蟲藍(MTT)，8-Br-cAMP和H-89均購自美國Sigma公司;RPMI1640培養基(干粉)、胎牛血清、D-Hanks均購自美國Gibco公司;無水甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸、異丙醇均為分析純，購自北京化學試劑公司。胰酶、青霉素和鏈霉素購自Gibco公司。

超凈工作臺(天津醫藥凈化設備廠);CO2細胞培養箱(美國Nap-co公司);Bio-Rad-550酶標儀(美國Metertech公司);低溫高速離心機、Nikon生物顯微鏡和NIS圖像采集分析系統(日本Nikon公司);電泳儀和轉膜機(美國Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養及MTT法［4］檢測L02細胞活性

液氮罐中取出凍存的L02細胞株，復蘇培養，培養基為 1640(含 10%FCS，青霉素100 kU·L－1，鏈霉素100 kU·L－1)，置 37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，24 h后更換培養基，細胞為單層貼壁生長，當細胞貼壁大于85%時(對數生長期)可傳代培養。

細胞傳至第四、五代狀態較好時，調整細胞密度108L－1，培養12 h后，大于85%的細胞貼壁，吸出原培養基，按組別分別加入含藥的無血清培養基，每孔加入 100 μl濃度為 10－3，10－4，10－5，10－6，10－7，10－8和10－9mol·L－1的 8-Br-cAMP 或 H-89 溶液，設5 個復孔，培養48 h，每孔加20 μl MTT 溶液5 g·L－1(pH=7.4)。繼續孵育4 h后，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加二甲亞砜150 μl，微量振蕩器振蕩10 min，在波長 570 nm酶標儀測定吸光度(absorbance，A)值，觀察8-Br-cAMP和H-89對細胞活力的影響。

1.3 L02細胞分組處理

L02細胞108L－1，接種于12孔板，正常對照組，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1組，H-89 10 μmol·L－1組，培養48 h后收集細胞，檢測相關指標，每組設3個平行，重復3次，測PKA的培養孔中放入圓形蓋玻片，細胞爬片后做免疫組化用。

1.4 免疫組化法檢測PKA表達

有蓋玻片的培養板小心吸去培養液，加入4%的多聚甲醛，4℃，固定24 h。取出蓋玻片，依次用PBS漂洗3×5 min，3%的H2O220 min。① 兔抗PKA抗體稀釋液(1∶100，武漢博士德)孵育24 h(4℃)，37℃復溫40 min，PBS漂洗3×5 min;②二抗羊抗兔IgG 37℃ 40 min，PBS漂洗 3×5 min;③ DAB 顯色。常規脫水、透明、封固，光鏡下觀察并拍攝照片。采用圖像分析系統測定PKA陽性免疫反應產物的積分灰度值(著色深者灰度值低)進行分析。

1.5 Western印跡法檢測PXR表達

小心傾去培養液，用PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集細胞，126×g離心5 min，小心吸出上清液，PBS再清洗，126×g離心5 min，倒凈 PBS，加入200 μl裂解液(1.4 ml單去污劑裂解液和 20 μl PMSF)，冰上裂解 30 min，4℃，13 427×g離心 8 min，吸取約 170 μl，－80℃保存待測。

采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，每孔加40 μl蛋白，采用SDS-PAGE電泳，13%分離膠，5%的濃縮膠，半干轉膜法將蛋白轉至PVDF膜上，0.5%脫脂奶粉封閉1 h后加入β肌動蛋白一抗4℃過夜(1∶2000)。用含吐溫-20的PBS(PBST)洗滌3次，每次5 min，加入二抗，密封，室溫1 h，PBST液洗3次，加入PXR 一抗(1∶150)，室溫1 h，PBST 液洗3 次，加二抗，PBST液洗3次，加顯色劑2 min，在暗室內壓膠片曝光，觀察結果并掃描分析。PXR表達水平用目的條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA)與內參β肌動蛋白條帶的IA比值定量表示。

1.6 紅霉素-N-脫甲基法檢測CYP3A的活性

傾去培養液，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集細胞，4023×g離心10 min，吸出上清液，加入0.2 ml pH 7.4的甘油磷酸緩沖液重懸細胞，用超聲破碎儀破碎細胞，1450×g，4℃離心15 min，取上清液，按照紅霉素-N-脫甲基法檢測CYP3A的活性［5］。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 8-Br-cAMP和H-89對L02細胞活力的影響

與正常對照組比較，8-Br-cAMP 1 mmol·L－1使細胞活性明顯降低(P ＜0.05)，H-89 1 和 0.1 mmol·L－1使細胞活性明顯降低 (表 1)。所以8-Br-cAMP和H-89選擇對細胞沒有損害的10 μmol·L－1作為實驗濃度。

表1 8-Br-cAMP和H-89對L02細胞活力影響Tab.1 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the activity of L02 cells

2.2 8-Br-cAMP和H-89對L02細胞PKA表達的影響

如圖1所示，PKA主要分布在胞漿之中，免疫組化染色后，可發現細胞胞漿中分布著棕黃色陽性顆粒。正常對照組有部分陽性細胞，胞漿分布有棕黃色顆粒，正常對照組PKA表達灰度值211±20相比，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1組陽性細胞數較多，且陽性顆粒著色較深，其陽性面積及PKA表達灰度值(296±18)明顯增加(P ＜0.05，P ＜0.01)，H-89 組陽性細胞數較少、顆粒著色也比較淺，PKA表達灰度值(176±14)顯著降低(P ＜0.05)。

2.3 8-Br-cAMP和H-89對L02細胞PXR表達的影響

與正常對照組比較，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作用于細胞后，細胞PXR表達明顯增強(P＜0.05)，而 H-89 10 μmol·L－1組 PXR 表達沒有明顯差異(圖2)。

圖18-Br-cAMP和H-89對L02細胞PKA蛋白表達影響 (×400).A:正常對照組;B:8-Br-cAMP 10 μmol·L－1組;C:H-89 10 μmol·L－1組.Fig.1 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the expression of PKA in L02 cells(×400).

圖2 Western印跡法檢測8-Br-cAMP和H-89對LO2細胞孕烷X受體(PXR)表達的影響.1:正常對照;2:8-Br-cAMP 10 μmol·L － 1;3:H-89 10 μmol·L －1 .Fig.2 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the expression of PXR in L02 cells detected by Western blotting.

2.4 8-Br-cAMP和 H-89對 L02細胞 CYP3A活性的影響

與正常對照組比較，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作用于L02細胞后，細胞CYP3A活性明顯增強(P＜0.05)，H-89 10 μmol·L－1組細胞 CYP3A 活性無明顯差異(表2)。

表28-Br-cAMP和H-89對L02細胞中CYP3A活性的影響Tab.2 Effect of 8-Br-cAMP and H-89 on the activity of CYP3A in L02 cells

3 討論

肝藥物代謝酶的表達及活性變化直接影響藥物的體內過程，使藥物血藥濃度變化，對機體產生不同的生物學效應。CYP3A是肝Ⅰ相藥物代謝酶中較為重要的代謝酶，介導臨床60%藥物的代謝，與藥物效應密切相關，CYP3A的表達主要由上游因子PXR調控。cAMP-PKA信號通路介導機體多種生物效應［6］，與 CYP3A 的表達也密切關聯［3］。

本研究通過體外實驗，觀察cAMP-PKA信號通路藥物代謝酶CYP3A的調控作用。L02細胞是體外培養的正常人類肝臟細胞，肝臟是藥物代謝酶存在的主要器官，因此L02細胞中有較完整的肝臟藥物代謝酶系，可作為體外實驗考察肝臟藥物代謝酶變化合適的細胞株。故實驗選用L02細胞，考察cAMP-PKA通路激動劑8-Br-cAMP、抑制劑H-89對L02細胞中CYP3A及PXR的影響，探討cAMP-PKA通路對CYP3A的調控的機制［7－8］。

實驗應用 MTT［8］法觀察8-Br-cAMP，H-89對細胞活性的影響，選擇合適的實驗濃度。結果顯示，8-Br-cAMP 1 mmol·L－1有一定的細胞毒性，隨著濃度降低，對細胞損害越小，8-Br-cAMP 10 μmol·L－1及更低的濃度時，對細胞基本沒有損害，故選用8-Br-cAMP 10 μmol·L－1作為實驗濃度。同樣選擇 H-89 10 μmol·L－1作為實驗濃度。

8-Br-cAMP 和 H-89 10 μmol·L－1作用于 L02 細胞后，PKA，PXR和CYP3A都發生變化。8-Br-cAMP 10 μmol·L－1，可以增強細胞中 PKA 和 PXR 表達，并上調 CYP3A 的活性，可見 8-Br-cAMP 10 μmol·L－1可以上調cAMP-PKA通路，并能增強PXR表達，從而使CYP3A 活性增強。H-89 10 μmol·L－1使 L02 細胞的PKA表達降低，對細胞的PXR表達、CYP3A的活性影響不大。可見，cAMP-PKA信號通路處于上調狀態時可以增強PXR表達，從而增加CYP3A的活性，說明cAMP-PKA信號通路可以調控CYP3A的表達。H-89 10 μmol·L－1使 cAMP-PKA 信號通路處于抑制狀態，PKA表達下降，PXR蛋白表達和CYP3A活性無明顯改變，說明cAMP-PKA信號通路抑制時，可能存在其他途徑誘導PXR介導的CYP3A的表達，其綜合效應使PXR蛋白表達和CYP3A活性無明顯變化，可見，除了cAMP-PKA信號通路，同時可能還有其他途徑共同調控CYP3A的表達。

cAMP-PKA信號通路在CYP3A表達中有積極意義，是影響CYP3A表達的途徑之一，進一步實驗宜從基因和蛋白層次觀察該通路對CYP3A表達的影響。可見，通過干預機體cAMP-PKA信號通路，影響CYP3A表達，可改變機體藥物代謝水平，為研究影響藥效的深層次機制提供實驗依據。

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