病人血漿中阿德福韋的濃度檢測方法及耐藥基因研究

劉曉茜，鄔 敏，姚亞敏，馬 芳，賈小芳，張麗軍

上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

阿德福韋(adefovir)是核苷類抗病毒藥物，能夠有效抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝病毒和皰疹病毒等各種病毒的復(fù)制和表達[1-3]。阿德福韋酯口服后，在血漿中或組織中經(jīng)細胞外激酶迅速水解為阿德福韋，在細胞內(nèi)經(jīng)腺苷酸激酶磷酸化后，形成具有藥物活性的雙磷酸阿德福韋，是HBV DNA聚合酶的競爭性抑制劑。阿德福韋酯耐藥變異的特點是變異發(fā)生晚且變異率比較低，聯(lián)合用藥可明顯減少耐藥株出現(xiàn)的幾率，目前應(yīng)用比較廣泛。如發(fā)生阿德福韋的耐藥情況及時檢測是否存在耐藥基因，會大大節(jié)約治療成本，治療效果也會有很大的改善。

目前有報道用高效液相色譜法測定血液和尿液中的阿德福韋，采用氯乙醛衍生化后測定或直接測定[4-6]，也有用LC-MS/MS測定，但是樣品處理方法比較復(fù)雜[7]。本文方法中，血漿樣本用量更少，除成功的分析了20份病人的血液標(biāo)本，另外還對這些病人進行了阿德福韋耐藥基因的檢測，對病人個性化給藥治療疾病有助益。

1 儀器和試藥

島津液相色譜LC-10AD，美國AB公司三重四極桿質(zhì)譜串聯(lián)色譜；BP211D電子分析天平 (德國SartoriusAG，精度 0.01 mg)；Milli-Q 超純水儀(美國Millipore公司)；振蕩儀（德國IKEA公司）；離心機（德國 Eppendorf公司，5415R）。

阿德福韋對照品（純度＞99%，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院惠贈）；阿昔洛韋（純度＞99%，中國藥品生物制品檢定所提供）；甲醇、甲酸為色譜純（Merk公司）；水為二次重蒸水。

2 溶液的配制及樣品處理

2.1 對照品溶液

精密稱取阿德福韋5 mg，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（甲醇︰水=20︰80）配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品母液，臨用時，精密吸取母液適量，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋至所需濃度。

2.2 內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取阿昔洛韋5 mg，用甲醇配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品母液，精密吸取1 mg·mL-1阿昔洛韋母液及甲醇，配制成10 ng·mL-1的溶液。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品0.2 mL放入2 mL離心管中，加入20 μL 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（甲醇:水=20︰80），并加入含有10 ng·mL-1阿昔洛韋的甲醇溶液0.4 mL，置于振蕩器上振蕩3min，以12000r·min-1高速離心10min，吸取上清液，上清液在37℃的金屬浴中用氮氣吹干，并加入0.2 mL流動相復(fù)溶，取20 μL用LC-MS/MS分析。

3 方法和結(jié)果

3.1 檢測條件

色譜條件色譜柱為安捷倫Eclipse XDB-C18(150 mm ×4.6 mm ID,5 μm)； 流動相為 0.1%甲酸水溶液-甲醇（80︰20）；柱溫為 40℃；流速 0.4 mL·min-1；進樣量為 20 μL。

質(zhì)譜條件離子源為ESI源，阿德福韋母離子為 274.3，子離子為 162.2，去簇電壓（DP）為 53 V，射入電壓（EP）為 5 V，碰撞能量（CE）為 40 V，掃描時間為0.2 s；阿昔洛韋母離子為226.2，子離子為152.4，EP 4V，CE 為 16 V，掃描時間為 0.2 s。

3.2 方法的專屬性

分別取6份人空白血漿0.2 mL，按“血漿樣品處理”項操作，進樣量20 μL，得色譜圖，如圖1A；將一定濃度的阿德福韋標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白血漿中，依同法操作，得色譜圖，如圖1B；阿德福韋的保留時間為3.2 min，內(nèi)標(biāo)的保留時間為3.3 min。取病人給藥后收集的血漿樣品，同法操作，得色譜圖，如圖1C。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿德福韋及內(nèi)標(biāo)的測定。

圖1 血漿中的阿德福韋色譜圖

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿0.2 mL，加入阿德福韋標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 20 μL， 配制相當(dāng)于質(zhì)量濃度為 1、5、10、20、50、100、160 ng·mL-1的血漿樣品， 除不加入 20 μL 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（甲醇:水=20︰80）外，按“血漿樣品處理”項下操作，樣品中待測物濃度為橫坐標(biāo)，以待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W=1/C2）最小二乘法進行回歸計算，求得直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。典型的回歸方程為：Y=9.57X+0.35，r=0.9972。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，阿德福韋的線性范圍為1～160 ng·mL-1，定量下限為 1 ng·mL-1。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿0.2 mL，按照“血漿樣品處理”項下操作制備15份提取后的空白樣品，再加入低、中、高3 個不同質(zhì)控樣本（1、20、100ng·mL-1），流動相復(fù)溶至200μL，進樣分析，記錄色譜峰面積。與相對應(yīng)同濃度的5份標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)果比較，以兩者的峰面積比值計算方法基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果低、中、高的基質(zhì)效應(yīng)分別為110.35%±6.32%、95.08%±5.68%，90.18%±4.56%，比值均在85%～115%，RSD%小于15%，表明本方法可有效避免人血漿基質(zhì)效應(yīng)。

3.5 準(zhǔn)確度與精密度

按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項進行操作，制備阿德福韋低、中、高 3 個質(zhì)量濃度（1、20、100 ng·mL-1）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每一個濃度進行6樣本分析，連續(xù)進行3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進行，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算QC樣品的濃度，將QC樣品的結(jié)果進行方法分析，求算本方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表1。

3.6 提取回收率和穩(wěn)定性考察

分別取低、中、高 3 個質(zhì)量濃度（1、20、100 ng·mL-1）的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項操作，以沉淀蛋白后的待測物色譜峰面積與未經(jīng)沉淀蛋白直接進樣獲得的色譜峰面積之比，考察樣品的提取回收率。每一濃度進行6樣本分析。3種濃度下樣品的提取回收率分別為75.60%±5.56%、78.32%±6.34%、85.38%±7.59%。提取回收率高于50%，RSD均小于15%。將低、中、高濃度共18份樣品峰面積代入當(dāng)日的工作曲線計算，得低、中、高濃度的方法回收率分別為110.58%±11.05%、105.36%±8.96%、100.26%±5.62%。

表1 方法的準(zhǔn)確度和精密度

據(jù)報道[8]阿德福韋血漿樣品室溫放置3 d，或于-20℃保存4.5個月或經(jīng)過4個冷凍-解凍循環(huán)，均保持穩(wěn)定，因此本文沒有考察這方面的內(nèi)容。根據(jù)實驗需要，考察了經(jīng)配制的標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在4℃冰箱放置2 d后阿德福韋降解了58%。表明阿德福韋溶解在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（甲醇︰水=20︰80）中非常不穩(wěn)定，另經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度越低降解的越快。

3.7 建立的檢測方法在病人血漿中的應(yīng)用

在病人血漿樣品測定過程中，每批樣品建立一標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時配置血漿低、中、高3個質(zhì)量濃度（1、20、100 ng·mL-1）QC 樣本， 每個濃度進行雙樣本分析，以判斷當(dāng)日結(jié)果的可靠性。應(yīng)用本方法測定了15名病人血漿中阿德福韋的濃度。這些病人都是連續(xù)重復(fù)給藥，每天早上服用一片（10 mg），血樣均在清晨采集，也就是說，服藥時間為23 h左右，此時阿德福韋的濃度均為谷濃度，檢測結(jié)果見表3。

3.8 套式PCR快速檢測阿德福韋耐藥突變在病人血漿中的應(yīng)用

3.8.1 辛酸鈉煮沸法快速抽提HBV-DNA收集病人血樣 500 μL，12000 r·min-1離心 10 min 取血清。將血清與辛酸鈉按2︰1比例混合均勻，100℃煮沸 10 min后，12000 r·min-1離心 10 min， 上清液中即含HBV-DNA成分。吸取凍存。

3.8.2 套式PCR擴增HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因。引物序列見表2。

表2 引物序列

PCR反應(yīng)體系為25 μL。第一輪采用50℃退火，72℃延伸55 s，25個循環(huán)。第二輪采用55℃退火，72℃延伸40 s，25～30個循環(huán)。

3.8.3 位點分析把PCR產(chǎn)物送至博尚生物技術(shù)有限公司用ABI 3730 XL測序儀進行測序，將測序所得核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，與HBV AH基因型比對，確定樣品的基因型。在此基礎(chǔ)上，運用vector NTI軟件與數(shù)據(jù)庫中所有該基因型的序列比對，篩查有無已報道的經(jīng)典的耐藥突變位點A181V和N236T[8]，檢測結(jié)果見表3。

表3 病人阿德福韋濃度和耐藥突變位點檢測結(jié)果

7號、17號、28號病人阿德福韋耐藥基因變異，可能這些病人的藥物治療濃度已經(jīng)達到要求，但是治療效果并不好，這就需要更換其他藥物治療；有一些病人如2號、44號、50號病人可能治療效果不理想，考慮可能為藥物濃度沒有達到治療的需要，還有可能是由于藥物代謝酶基因多態(tài)性引起的對阿德福韋的代謝有差異，進而表現(xiàn)為臨床藥物濃度低于治療水平，因此需要給這些病人提高藥物的治療劑量。這些病人都是長時間服用阿德福韋的，少則半年以上，多則4年，從檢測結(jié)果可以看到檢測的病人中有阿德福韋耐藥基因的病例數(shù)占總病例數(shù)的20%，也說明了阿德福韋的耐藥發(fā)生比較晚，且變異率不高。

4 討 論

本實驗嘗試了在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 （甲醇︰水=20︰80）中增大甲醇的比例，為甲醇︰水=50︰50，以減少標(biāo)準(zhǔn)品阿德福韋的分解，但是發(fā)現(xiàn)稀釋液比例改動后阿德福韋的標(biāo)準(zhǔn)品不能完全溶解，會導(dǎo)致檢測結(jié)果極為不準(zhǔn)確，因此要用極性大的稀釋液才能完全溶解阿德福韋。實驗中還發(fā)現(xiàn)配置好的阿德福韋極為不穩(wěn)定，降解非常快，因此建議做阿德福韋的樣本都要當(dāng)天重新配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并立即處理，以防阿德福韋降解導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。

本方法建立的阿德福韋的檢測方法快速、準(zhǔn)確、可操作性強，能夠及時對病人的阿德福韋血藥濃度進行檢測，為以后建立細胞內(nèi)阿德福韋的藥物濃度分析方法、研究病人細胞內(nèi)阿德福韋藥物代謝提供非常有價值的參考。

應(yīng)用所建立的分析方法首次對病人的血漿進行檢測，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)判斷病人服用該藥的治療效果，為臨床用藥提供可靠的指導(dǎo)；首次同時檢測病人服用阿德福韋的濃度及其該藥的耐藥基因，由于病人的血樣難于采集，病人的樣本數(shù)還比較少，得到的結(jié)果還不能非常好的說明問題，但是也可以從中得到啟示，應(yīng)該從哪幾個方面找出藥物治療效果不好的原因并及時測定需要檢測項目，使之給出解決方案。

血藥濃度與基因聯(lián)系起來解決給藥難題也是最近幾年興起的研究熱點[9-10]，許多藥物在這兩個方面同時研究的也比較多。本文在國內(nèi)首次同時檢測同一個病人阿德福韋的血藥濃度及耐藥基因，從檢測這兩個項目可以判斷療效不理想是由于藥物濃度沒有達到要求而引起的、還是由于病人存在藥物耐藥基因引起的，進而能找到更好的解決方案。如果有條件能同時檢測病人的耐藥性基因、藥物代謝酶基因多態(tài)性以及阿德福韋的藥物濃度，則可以真正地實現(xiàn)個體化給藥，排除各個因素的干擾，減少藥物的不良反應(yīng)，這也是醫(yī)務(wù)工作者一直追求的治療方向——患者個性化給藥。但是，在臨床實踐中，治療藥物濃度檢測與基因?qū)騻€體化給藥治療方法的如何實施，依據(jù)每個患者情況怎樣制定給藥方案和給藥劑量，仍需進一步大規(guī)模的臨床研究。

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