淺談口蹄疫疫苗生產(chǎn)過(guò)程中消毒和消毒劑的應(yīng)用

吳必武

(云南省保山疫苗廠，云南 保山 678000)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的偶蹄動(dòng)物共患的一種急性、烈性、接觸性傳染病。口蹄疫病毒對(duì)酸堿都特別敏感，在pH 7.2～7.6時(shí)穩(wěn)定性較強(qiáng);在低溫下十分穩(wěn)定，但對(duì)熱敏感;經(jīng)紫外線(xiàn)照射后，其病毒RNA的尿嘧啶形成二聚物，致使FMDV迅速被滅活;電離輻射也可使病毒滅活;FMDV不含有囊膜，所以對(duì)脂溶劑(氯仿、丙酮等)有抵抗力。目前控制和撲滅口蹄疫最有效和最經(jīng)濟(jì)的手段是接種安全有效的疫苗。我國(guó)主要應(yīng)用于預(yù)防接種的是常規(guī)(細(xì)胞培養(yǎng))滅活疫苗。

在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中消毒與滅菌的方法是否得當(dāng)，效果是否可靠，是疫苗生產(chǎn)能否順利進(jìn)行的重要影響因素。現(xiàn)對(duì)口蹄疫疫苗生產(chǎn)過(guò)程中消毒與消毒劑的應(yīng)用、種類(lèi)及影響因素等方面進(jìn)行探討，這對(duì)口蹄疫疫苗的規(guī)范生產(chǎn)和質(zhì)量控制具有實(shí)用意義。

1 口蹄疫疫苗生產(chǎn)過(guò)程常用消毒方法

為了保證細(xì)胞培養(yǎng)與病毒接種的正常進(jìn)行，疫苗生產(chǎn)過(guò)程中所用的大量玻璃器皿、橡膠制品、各種溶液、金屬器械及潔凈工作服均需要消毒滅菌。其中無(wú)菌間等生產(chǎn)車(chē)間、人員手部以及各種金屬器械一般用化學(xué)方法或紫外線(xiàn)輻射進(jìn)行消毒。

1.1 紫外線(xiàn)消毒

紫外線(xiàn)的殺菌波長(zhǎng)范圍是265～268 nm，它可以引起DNA中形成胸腺嘧啶二聚體，干擾DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致細(xì)菌變異或死亡。紫外線(xiàn)消毒對(duì)被消毒物品的損傷小，無(wú)殘留毒性，且經(jīng)濟(jì)方便，對(duì)設(shè)備要求不高，使用范圍廣，安全可靠，但紫外線(xiàn)的穿透能力弱，不能通過(guò)普通玻璃、塵埃，只能用于消毒物體表面、空氣及無(wú)菌操作室，也可用于不耐熱物品表面消毒。

1.1.1 對(duì)空氣消毒

對(duì)空氣消毒的最好方法之一是使用空氣過(guò)濾和紫外線(xiàn)照射相結(jié)合。一般每10～15 m2面積安裝30 W紫外線(xiàn)燈管1支，燈管安裝于距地面2.0～2.5 m高處，由于空氣能自由流動(dòng)，所以一般都能得到消毒。在室溫20～40℃，相對(duì)濕度不高于60%時(shí)，照射30 min即可達(dá)到消毒要求。

1.1.2 對(duì)水的消毒

用紫外線(xiàn)消毒水的優(yōu)點(diǎn)是水中不必添加其它消毒劑或提高溫度。紫外線(xiàn)消毒水時(shí)，照射劑量要在90 000μW·s/cm2以上，且水層不宜超過(guò)2 cm。紫外線(xiàn)在水中穿透力，隨深度的增加而降低，如表1。

表1 蒸餾水深度對(duì)紫外線(xiàn)穿透的影響

1.1.3 對(duì)污染表面的消毒

在無(wú)菌間，紫外線(xiàn)等一般安裝在層流罩下，燈管功率不少于2W/m2，照射時(shí)間為30 min，消毒的有效范圍在1.5～2.0 m處，照射劑量要在10 000μW·s/cm2以上。在開(kāi)始工作和工作完畢后，打開(kāi)紫外燈，使工作臺(tái)面完全暴露，照射30 min，可達(dá)到消毒目的。使用時(shí)應(yīng)注意要保證足夠的輻射強(qiáng)度和足夠的照射時(shí)間，以確保消毒的效果。

1.2 化學(xué)消毒

消毒劑對(duì)一切細(xì)胞原生質(zhì)均有毒性，其作用機(jī)制有:使菌體蛋白凝固變性;干擾細(xì)菌酶的活性，抑制細(xì)菌代謝和生長(zhǎng);損害細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，改變其通透性，破壞其生理功能等，從而起到消毒滅菌作用。生產(chǎn)車(chē)間常用的化學(xué)消毒劑有甲醛、氫氧化鈉、新潔爾滅、甲酚皂等。

1.2.1 對(duì)無(wú)菌間的消毒

每次使用無(wú)菌間后，必須用0.2%新潔爾滅溶液、5%甲酚皂溶液擦拭臺(tái)面及各種器皿，并用上述溶液擦拭地面。新潔爾滅溶液和甲酚皂溶液應(yīng)交替使用，以防細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性。除此之外，還應(yīng)定期或不定期的用化學(xué)熏蒸法進(jìn)行消毒，一般每月1次。對(duì)無(wú)菌間的熏蒸消毒一般采用甲醛熏蒸和過(guò)氧乙酸熏蒸，但這兩種方法所需熏蒸時(shí)間長(zhǎng)，均在12～24 h，并且由于熏蒸后消毒劑殘留嚴(yán)重，對(duì)人體影響較大，消毒后無(wú)菌間不能立即使用，影響生產(chǎn)的正常進(jìn)行，所以在疫苗生產(chǎn)中不常使用，只有在更換病毒血清型時(shí)才用。目前通常采用臭氧熏蒸法，該法具有殺菌消毒譜廣、殺菌消毒率高、殺毒速度快(比甲醛熏蒸縮短6倍)、安全無(wú)殘毒等優(yōu)點(diǎn)，在消毒完畢30 min后，人員即可進(jìn)入，不影響正常生產(chǎn)。

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》和實(shí)踐應(yīng)用數(shù)據(jù)，在GMP制藥車(chē)間的潔凈區(qū)，潔凈級(jí)別十萬(wàn)級(jí)消毒需要保持臭氧濃度為10 mg/m3，萬(wàn)級(jí)為30 mg/m3。在消毒過(guò)程中濕度要控制在70% ～80%，低于45%時(shí)消毒效果就會(huì)受到很大影響。

1.2.2 對(duì)物品的消毒

進(jìn)入萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)的物品，除用熱力滅菌之外，其余物品如血清瓶、消毒液等，均需用0.2%新潔爾滅或5%甲酚皂擦拭容器外壁消毒。病毒區(qū)使用過(guò)的細(xì)胞瓶在裝入滅菌柜之前要用4%NaOH 500 mL涮洗內(nèi)壁，凍破的病毒液瓶應(yīng)浸泡在4%NaOH中24 h以上。各種設(shè)備、金屬儀器如干燥箱、高壓柜、顯微鏡等應(yīng)定期用消毒液擦拭，一般每3天1次。在細(xì)胞的傳代過(guò)程中，操作人員的手每接觸一次細(xì)胞瓶口，都要用酒精棉球擦拭手及瓶口。

2 影響消毒效果的因素

各種消毒滅菌方法都有其影響因素，在使用過(guò)程中如不注意這些影響因素，就可能會(huì)對(duì)消毒效果產(chǎn)生直接影響。各種消毒滅菌方法的影響因素簡(jiǎn)述如下:

2.1 影響熱力消毒和滅菌的因素

(1)微生物的種類(lèi)和生存環(huán)境:不同種類(lèi)的微生物或是同種但非同種株的微生物的熱耐受力是不一樣的。微生物的生存環(huán)境對(duì)其耐熱能力有很大影響。當(dāng)微生物生存在富含血清、蛋白質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)在內(nèi)的環(huán)境時(shí)，對(duì)熱的抵抗力將會(huì)增強(qiáng)。

(2)加熱時(shí)的環(huán)境:加熱時(shí)，微生物外環(huán)境中的氣壓、酸堿度、離子的濃度等都可影響消毒效果。

(3)被消毒物的種類(lèi)和大小:不同種類(lèi)的被消毒物品，其傳熱能力不同。金屬制品消毒時(shí)，一般15 min即可，而傳熱能力差的衣物等則要30 min。

2.2 影響過(guò)濾除菌的因素

影響過(guò)濾除菌效果的因素主要有過(guò)濾材料的結(jié)構(gòu)、特性、濾床的層次以及濾孔大小、纖維帶電的強(qiáng)弱等。一般濾器的孔徑小于0.5～5.0μm即可達(dá)到良好的除菌目的。濾床層次多、濾料纖維帶電強(qiáng)時(shí)，過(guò)濾除菌效果會(huì)增強(qiáng)。

2.3 影響紫外線(xiàn)消毒作用的因素

2.3.1 微生物自身的因素

(1)微生物的類(lèi)型:不同微生物對(duì)紫外線(xiàn)照射的敏感性不同，對(duì)紫外線(xiàn)最為敏感的是革蘭氏陰性菌，其次為革蘭氏陽(yáng)性菌，再次為芽孢。病毒也能被紫外線(xiàn)滅活。

(2)微生物的數(shù)量:微生物的數(shù)量越多，需要產(chǎn)生相同致死作用的紫外線(xiàn)照射劑量也就越大。

(3)生長(zhǎng)期或芽生期的差別。

(4)懸浮的類(lèi)型:枯草桿菌芽孢在灰塵中懸浮比在氣溶膠中懸浮時(shí)，對(duì)紫外線(xiàn)照射有更大的抗性。

2.3.2 有機(jī)物的影響

胨、蛋、牛奶，特別是血和血清的存在對(duì)紫外線(xiàn)的消毒效果有一定影響，當(dāng)有機(jī)物存在時(shí)，需延長(zhǎng)消毒時(shí)間。

2.3.3 環(huán)境因素

(1)溫度的影響:大多數(shù)的微生物(除了耐輻射微球菌屬外)在低溫時(shí)對(duì)紫外線(xiàn)輻射很敏感。另外，環(huán)境溫度對(duì)紫外線(xiàn)燈的輸出強(qiáng)度也有影響，一般以室溫條件(27～40℃)輸出強(qiáng)度最大，環(huán)境溫度過(guò)高或過(guò)低都使輸出強(qiáng)度降低。

(2)濕度的影響:紫外線(xiàn)照射消毒時(shí)要求相對(duì)濕度在60%以下。

2.3.4 紫外線(xiàn)輻射波長(zhǎng)的影響不同波長(zhǎng)紫外線(xiàn)的殺菌力不同，如表2。

表2 不同波長(zhǎng)紫外線(xiàn)殺菌力比較

2.4 影響化學(xué)消毒效果的因素

2.4.1 消毒劑方面的因素

(1)藥物的特異性:某些藥物只對(duì)某一部分微生物有抑制作用，而對(duì)另一些微生物則效力很差。

(2)藥物的濃度:消毒劑的消毒效果一般與其濃度成正比。

(3)消毒劑的物理狀態(tài):只有溶液才能進(jìn)入微生物體內(nèi)，起到應(yīng)有的消毒效果。所以固體消毒劑必須溶于水中，氣體消毒劑必須溶于細(xì)菌周?chē)簩又校庞袣⒕饔谩?/p>

2.4.2 環(huán)境方面的因素

(1)溫度:一般消毒劑，當(dāng)溫度升高時(shí)，殺菌能力加強(qiáng)。

(2)濕度:每種氣體消毒劑都有其適宜的相對(duì)濕度。

(3)pH:酸堿度對(duì)細(xì)菌和消毒劑均有影響。pH改變時(shí)，細(xì)菌的電荷也發(fā)生改變。同時(shí)，pH值也影響消毒劑的電離度。

(4)有機(jī)物的存在:覆蓋于菌體表面的有機(jī)物，具有機(jī)械性保護(hù)作用。

(5)接觸時(shí)間:微生物與消毒劑接觸的時(shí)間愈久，死亡數(shù)目愈多，消毒效果越好。

2.4.3 微生物方面的因素

(1)微生物種類(lèi)及其特性:不同種類(lèi)的微生物對(duì)各類(lèi)消毒劑的敏感性是不完全一樣的;細(xì)菌的繁殖體及其芽孢對(duì)化學(xué)藥物的抵抗力不同;生長(zhǎng)期和靜止期的細(xì)菌對(duì)消毒劑的敏感程度亦有差別。

(2)微生物的數(shù)量:微生物的數(shù)量越多，所需消毒劑劑量就越大，需要作用的時(shí)間也越長(zhǎng)。

3 結(jié)論

在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中消毒與滅菌的方法是否得當(dāng)，效果是否可靠，是疫苗生產(chǎn)能否順利進(jìn)行的重要影響因素。因此不斷的總結(jié)、研究疫苗生產(chǎn)過(guò)程的消毒方法、消毒劑類(lèi)型對(duì)疫苗生產(chǎn)順利進(jìn)行、疫苗質(zhì)量的提升將起到極大的促進(jìn)作用。