2株鴿源新城疫病毒的毒力鑒定和基因型分析

高以明 ，張敬友 ，王水明 ，柯家法 ，李超美 ，朱雪良 ，張 揚 ，嚴繼寧 ，黃立業 ，任曉進 ，吳艷濤 ，劉文博

（1.南京農業大學，江蘇 南京 210095；2.南京出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001；3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001；4.揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇揚州 225009）

鴿新城疫又稱鴿Ⅰ型副黏病毒病，是由新城疫病毒（又稱鴿副黏病毒Ⅰ型）引起的一種急性高度接觸性敗血性傳染病，以腸炎、嚴重腹瀉和神經癥狀為特征[1-3]，其發病率為50%～100%，病死率達20%～95%。該病于1977年發生在中東地區，次年在埃及和伊拉克發生[1]。隨后迅速傳播到歐洲、美國、加拿大等地，1985年傳播到亞洲[4-6]。1986年前后我國的鴿群中也發現了該病[7]，現全國各省市均有報道[8-13]。

早期對鴿新城疫病毒的研究發現，鴿源新城疫病毒與當時雞源新城疫病毒抗原性和生物學特性有一定的差異[1，14-15]，基因型主要是Ⅵb 亞型[6，16-17]，對雞的致病性與雞源新城疫病毒不同[3，5，8，21]，然而，隨著時間的推移、禽類養殖方式和規模等的改變，鴿源新城疫病毒也出現了一定的變化[18-23]。本實驗對從臨診病例中分離到的兩株鴿源新城疫病毒進行了毒力測定和基因型分析，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 病毒和其他生物材料 兩個鴿源NDV分離株是按照國際動物衛生組織（OIE）推薦的方法[24]在2008年從臨床鴿病例中分離，命名JS-1-08-Pi和JS-2-08-Pi；SPF雞胚購自山東家禽研究所SPF雞場。

1.2 主要試劑 禽成髓細胞病毒反轉錄酶（AMV）購自 TOYOBO 公司；200 bp DNA Marker、DNA 凝膠回收試劑盒、dNTP購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶EcoR I為MBI公司產品；pCR2.1 載體、Trizol、DH5α 大腸桿菌為 Invitrogen 公司產品；Ampicilin、X-gal、IPTG 購自Sigma公司；DEPC購自BBI公司。

蛋白胨和酵母抽提物購自英國OXOID公司；瓊脂粉瓊脂糖為西班牙產品；醋酸鈉（NaAc）、十二烷基磺酸鈉（SDS）系Sigma公司產品；三氯甲烷（氯仿）、異丙醇、異戊醇、乙酸鉀、冰乙酸和三羥基甲基氨基甲烷等常規試劑購自中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；飽和酚為南京生物工程公司產品。

1.3 主要儀器 PTC-200型PCR儀、3000XI型電泳儀購自美國BIO-RAD公司；恒溫金屬水浴鍋CHB-100型購自杭州大和熱磁電子有限公司；RC232C型紫外分光光度計、臺式高速離心機購自德國eppendorf公司；純水儀Milli-Q低熱原型購自美國Millipore公司。

1.4 引物 參照已發表的NDV毒株基因的核苷酸序列，應用Primer Premier5.0設計了兩對引物，P1和P2擴增M基因1161 nt至F基因889 nt間長約970 pb的片段，P3和P4擴增F基因862 nt至F基因1700 nt間長約839 bp的片段。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列為:

1.5 病毒毒力的測定 按照世界動物衛生組織（OIE）介紹的方法進行[24]。

1.6 病毒RNA的提取和cDNA的合成 NDV毒株的RNA抽提按照Trizol試劑說明書進行。cDNA的合成按照參考文獻進行[17]。

1.7 NDV F基因的克隆 F基因的RT-PCR擴增按有關文獻報道的方法進行[17]。RT-PCR擴增產物克隆到pGEM-T Easy Vector，轉化感受態大腸桿菌，篩選陽性克隆。

1.8 序列測定和推導氨基酸序列分析 篩選出的F基因陽性克隆寄送到上海生工生物工程技術服務有限公司測定核苷酸序列，用DNAStar 5.0版本軟件包的軟件（DNASTAR Inc.Madison，WI153715，USA）分析F基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。

1.9 NDV系統進化發生樹和限制性內切酶位點分布分析 參考已報道的方法[16-17]，根據F基因47nt～420 nt之間的374 bp片段的核苷酸序列繪制NDV系統進化發生樹，同時分析F基因334nt～1682nt之間的1349 bp片段上HinfⅠ、BstOⅠ和RsaⅠ三種限制性內切酶位點。

2 結果

2.1 病毒毒力的測定結果 2株新城疫病毒毒株，經毒力檢測測得雞胚平均死亡時間（MDT）分別為48h和46 h，8周齡SPF雞靜脈接種指數（IVPI）分別為2.88和2.91，一日齡雛雞腦內接種指數（IPCI）分別為1.88和1.89，均判定為強毒株。

2.2 NDV F基因片段的擴增、克隆 該毒株經RT-PCR均擴增出了大小為970 pb和839 bp的特異性條帶。

2.3 NDV F基因序列測定和序列分析

2.3.1 NDV F基因序列測定和推導氨基酸序列分析

根據測得的F基因核苷酸序列推導出相應編碼氨基酸，蛋白酶裂解位點附近的氨基酸序列為112R（K）RQKR↓F117，符合NDV強毒株的規律[25]。

2.3.2 NDV系統進化發生樹和限制性內切酶位點分布

用DNAStar軟件對2個鴿源分離株和28個參考毒株的F基因47 nt～420 nt區域進行比較，繪制了系統進化發生樹（圖1）。結果顯示，兩個毒株分布在一個分支上，為基因Ⅶ型。

F基因334 nt～1682 nt間三種限制性內切酶（HinfⅠ、BstOⅠ和RsaⅠ）位點分布是基因分型的另一個標準[7-8]。本文中所分離到的鴿源NDV分離株歸于Ⅶ型，它們具有特定的限制性內切酶位點分布。在736nt，883nt具有 HinfⅠ位點，而在 1198 nt，1350 nt不具有 HinfⅠ位點，在 752 nt，1116 nt具有 HinfⅠ位點，而在 953 nt，1478 nt、1601 nt不具有 HinfⅠ位點，在 872 nt，973 nt、1249 nt具有 HinfⅠ位點，而在540 nt，683 nt、1593 nt、1625 nt不具有 HinfⅠ位點。

3 討論

從臨床病鴿體內分離到了2株NDV，毒力測定結果表明，2株新城疫病毒毒株的MDT分別為46 h和 48 h，IVPI分別為 2.88和 2.91，IPCI分別為 1.88和1.89，按照OIE推薦的標準為強毒株。F蛋白裂解位點的氨基酸推導序列為112R（K）RQKR↓F117，符合強毒株的分子特征。遺傳發生分析表明這兩個毒株與同期其它禽群中發生新城疫的毒株親緣關系很近。

早期研究表明鴿源新城疫病毒抗原性和基因型均有一定的特征，單抗分排譜屬于P組[14]，基因型屬于Ⅵb亞型[16]。1996年我國承辦國際信鴿比賽后，排出的病毒使得大范圍ND流行。國內不少學者對病原進行了分離和研究。劉文斌等分離到一株鴿源NDV，為基因Ⅵ型[26]。韋平等分離到一株鴿源毒株gxp22也為Ⅵb亞型[27]。劉華雷等分到5株鴿源毒株基因型也為基因Ⅵ型[28]。而本文中分離到的毒株屬于Ⅶc亞型。這表明Ⅶc亞型NDV在鴿群中存在，這與以往經典Ⅵb亞型毒株占優勢相比出現了新的變化。

對于鴿源新城疫病毒毒力的研究表明，與OIE推薦的標準以及裂解位點氨基酸序列標準不一致。于守平報道了2004年12月份吉林省肉鴿一例NDV，并分離到了一株強毒株[13]。連宏軍等從黑龍江發病鴿場分離了兩株NDV，經毒力鑒定為強毒株[29]。梁華麗從發病鴿分離出的NDV為弱毒[30]。韋平等分離到的鴿源毒株gxp22裂解位點氨基酸序列為強毒序列，而IVPI為0[27]。劉華雷等報道的5株鴿源毒株裂解位點氨基酸序列為強毒序列，但未進行毒力的測定[28]。李檸等和謝青梅等人的報道也表明鴿源毒株對雞的致病力差異很大[31-32]。Dortmans J C等人2009年的一篇報道表明鴿源毒株裂解位點氨基酸序列并不總與毒力相關[33]。（2002我們分離的一株鴨源NDV裂解位點氨基酸序列為典型強毒序列，但IVPI為0，未發表。）本文中分離到的兩株鴿源新城疫病毒毒力均較高，且裂解位點氨基酸序列為強毒。以上研究都表明我國鴿群中新城疫病毒的毒力和生物學特性存在較大差異。

從發病禽分離到的病毒按照OIE推薦的判定標準鑒定為弱毒的病毒毒株，這說明不同的新城疫毒株對不同宿主的致病力有一定差異。完全用對NDV非常敏感的雞作為新城疫毒株的唯一試驗宿主可能會影響對新城疫病毒毒力正確的判定。

我國鴿的飼養量越來越大，除肉鴿外，信鴿、賽鴿等一些名貴的鴿種也越來越多，隨著養殖量增加和規模擴大，疫病防控的難度也隨之加大。而由于其它野生禽類，家養禽類可能的帶毒排毒狀態，會加大養鴿的風險。建立不同禽類新城疫病毒監測體系，對該病的分子流行病學和病原變異進行監控，對于控制新城疫在我國禽群和其它動物群內的傳播有著非常重要的意義。因此，對臨診分離到的病毒進行病原體的生物學特征和遺傳變異進行監測對該病的防控十分重要。

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