HPLC法快速測定肺癌患者血漿中依托泊苷的濃度及其治療窗考察

劉治安，彭玉龍，許斌，莫炫永，蔡宇（.廣東東莞市東華醫院，東莞市 50；.廣東東莞市國藥質量檢測中心，東莞市 500；.暨南大學，廣州市 506）

臨床上肺癌是最常見的惡性腫瘤，其化療方案中常用抗腫瘤藥是依托泊苷（Etoposide，VP-16）[1]。VP-16是天然產物鬼臼脂的半合成衍生物，在體內代謝由細胞色素P450（CYP）3A酶催化，VP-16的療效和毒性與血藥濃度、體內藥物代謝酶的活性有較強的相關性[2]。為使VP-16能安全、有效地用于肺癌患者，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定其在肺癌患者中的血藥濃度，并結合臨床療效和不良反應的觀察結果，建立肺癌患者VP-16最佳血藥濃度范圍。

1 材料

1.1 儀器

1200RRLC高分離度快速液相色譜儀，包括G1314B VWD SL紫外檢測器、G1312B Bin Pump SL二元泵、G1316B TCC SL柱溫箱、G1329B ALS SL標準自動進樣器（美國Agilent公司）；TDL-5-A低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

VP-16對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:100388-200401）；甲醇為色譜純，水為蒸餾水（經0.2 μm微孔濾膜過濾）；空白人血漿為廣東東莞市東華醫院檢驗科提供的健康體檢者血漿。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry?C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流動相:甲醇-水（45∶55，流動相在使用前需經0.2 μm微孔濾膜過濾）；流速:1mL·min－1；檢測波長:220 nm；進樣量:20μL；柱溫:30℃。

2.2 血漿樣品的處理

患者用藥后45min時采血5～6mL，常溫靜置2 h，取血漿3mL離心（4000 r·min－1）10min，精密量取血清1.00mL，再精密加入甲醇至2.00mL，渦旋混勻1min，靜置10min，再離心（4000 r·min－1）10min，取上清液用0.2 μm微孔濾膜過濾，取續濾液即得。進樣20μL測定，記錄色譜圖（分析時間為12min），VP-16的保留時間約為7.52min。高效液相色譜圖見圖1。

2.3 檢出限及定量限的測試

開啟HPLC儀，運行約3 h至儀器基線平直后，量取基線噪聲（N），按3倍N的電平值（mV）確定最小檢出峰面積。再配制含依托泊苷為5.0、10.0μg·mL－1的模擬血漿樣品數份，按“2.1”項色譜條件進行操作，據其圖譜的依托泊苷峰面積，按最小檢出峰面積計算本方法的最小檢出濃度，即檢出限，結果檢出限為1.295μg·mL－1；再以檢出限的2～3倍估算本方法的定量限，為2.59μg·mL－1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血清；B.依托泊苷對照品溶液；C.受試者血樣；1.VP-16Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank serum；B.etoposide control；C.blood sample of object；1.VP-16

2.4 標準曲線的制備

準確稱取依托泊苷對照品2.59mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇使之溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得標準貯備液。精密量取VP-16標準貯備液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mL，再精密加入健康人空白血清至2.00mL，混勻，精密量取1.00mL，按“2.1”項色譜條件進行操作，記錄色譜。根據VP-16色譜峰的峰面積用外標法定量，以VP-16濃度（c）對峰面積（A）進行線性回歸，得回歸方程為A＝51089985.3934c+278656.3980（r＝0.9997）。結果表明，依托泊苷血藥濃度在2.59～51.8μg·mL－1范圍內線性關系良好。

2.5 進樣重復性試驗

取空白人血漿1.0mL，加入依托泊苷標準貯備液，使之成濃度為10.4μg·mL－1的依托泊苷血漿溶液。按“2.1”項色譜條件進行操作，進樣6次記錄峰面積，計算峰面積的RSD為0.2%（n＝6）。

2.6 方法回收率及精密度試驗

用標準貯備液配制成VP-16低、中、高3種不同濃度血清（每濃度5管），按“2.2”項下方法操作，計算出平均回收率。另取上述低、中、高濃度血清樣品，每濃度日內測定5次，計算日內RSD；同法每濃度連續5 d，每日測定5次，計算日間RSD，記錄結果，回收率及精密度試驗結果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝5）

2.7 貯備液的穩定性考察

取VP-16對照品的貯備液，分別在第1、7、14、30、60、90天用流動相配制成濃度為50.0、25.0、10.0μg·mL－1的溶液，直接進樣20μL，記錄峰面積，計算得RSD平均值為1.8%。

2.8 對照品加血漿的穩定性考察

制備高、低2種濃度（10.0、5.0μg·mL－1）VP-16對照品血漿各5份，按“2.2”項方法操作，分別在第0、4、8、12、16 h時進樣20μL，記錄對照品及內標的峰面積。計算高、低2種濃度的VP-16對照品峰面積的RSD平均值為0.7%。

2.9 藥物之間的干擾性試驗

筆者選擇了臨床常與VP-16合用的藥物進行考察，選定使用較多的藥物有苯巴比妥、維拉帕米及多種抗癌藥如氟尿嘧啶、阿霉素、順鉑、環磷酰胺、阿糖胞苷和羥基脲，結果受試者血清樣品圖譜顯示，其他藥品保留時間均＜6min，無干擾VP-16的色譜峰，表明本法測定VP-16的專一性強。

2.10 結果分析

在本院化療的40例肺癌患者中，剔除使用VP-16前經臨床檢查有心、肺、肝、腎功能不全及化療療程不足者4例，選擇余下36例分為3組，連續5次，每日1次（或隔日1次）根據常規分別給予依托泊苷50、75、100mg·m－23種劑量組靜脈滴注后，在第45min時采血，置于無抗凝劑試管中，常溫靜置2 h，按“2.2”項下方法操作后取血清1.00mL測定VP-16濃度，同時判定臨床療效和觀察不良反應，結果見表2。

表2 依托泊苷臨床療效、不良反應與血藥濃度關系Tab 2 Correlation of clinical efficacy of etoposide with adverse drug reaction and plasma concentration

3組血藥濃度兩兩比較結果顯示，3組間差異均有統計學意義（P＜0.05）；劑量75mg·m－2組與100mg·m－2組療效差異無統計學意義（P＝0.48），劑量50mg·m－2組與75mg·m－2組療效差異有統計學意義（P＜0.01）；劑量50mg·m－2組與100mg·m－2組不良反應差異有統計學意義（P＜0.01），劑量50mg·m－2組與75mg·m－2組、劑量75mg·m－2組與100mg·m－2組不良反應差異均無統計學意義（P＝0.10、0.08）。綜上，劑量75mg·m－2組的血藥濃度為最佳血藥濃度范圍。

3 討論

本研究是用一種快速、靈敏、準確、樣品處理簡單的方法對VP-16進行體內血藥濃度測定，旨在研究肺癌患者聯合使用多種藥物后，快速檢測血漿中VP-16的藥物濃度。

有關VP-16血藥濃度測定方法，文獻報道有內標法[3]和外標法，血漿樣本的處理方法多以氯仿或乙酸乙酯提取VP-16[2，4]，揮干提取液后以流動相溶解殘留液進樣。本法則以甲醇對樣品進行混勻，沉淀蛋白，再以0.2μm微孔濾膜過濾后，取濾液進樣，方法簡單，回收率高，故省略了提取回收率試驗。其準確度和定量限符合患者實際治療后VP-16的測定要求，適合于VP-16體內濃度的快速分析。對其中6名肺癌患者在使用劑量為100mg·m－2時，測定VP-16的濃度范圍在5～15μg·mL－1之間，同文獻報道的結果相似[5]。

VP-16的臨床療效按世界衛生組織（WHO）制定的指標為評價標準。療效分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩定（SD）及進展（PD），有效為CR+PR，無效為SD+PD；不良反應分為1～4度。其不良反應有骨髓抑制如白細胞減少、血小板減少、貧血，消化道反應如惡心、嘔吐、食欲不振、口腔炎、腹瀉、腹痛、便秘等，皮膚及其附件反應如皮疹、紅斑、瘙癢，其他如脫發、手足麻木、頭痛、發熱、心電圖異常、低血壓、靜脈炎等癥狀。本文選擇對機體影響大的骨髓抑制作為觀察對象。

本文得出的結論是肺癌患者VP-16血藥濃度治療窗應為6.525～9.115μg·mL－1，在此濃度范圍時，該藥物使用安全、有效。

[1]吳一龍主編.肺癌多學科綜合治療的理論實踐[M].第1版.北京:人民衛生出版社，2001:128、230.

[2]陸曉彤，唐躍年，張 健，等.高效液相色譜法測定兒童白血病患者中依托泊苷血藥濃度[J].中國藥房，2006，17（14）:1075.

[3]葛勇前，陸國椿.高效液相色譜法測定人血漿依托泊苷濃度[J].中國臨床藥學雜志，2001，10（5）:305.

[4]趙國琴，許健健，張海燕，等.HPLC法測定皮下植入依托泊苷的血漿濃度[J].中國新藥雜志，2003，12（3）:197.

[5]陸基宗，許英華，賀 晴，等.高效液相色譜法測定白血病人依托泊苷血藥濃度及其藥物動力學研究[J].中國現代應用藥學雜志，2001，18（1）:37.