RP-HPLC法測定氨茶堿血清濃度

黃丹，路曉欽，董志（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶市 400016；重慶市第九人民醫(yī)院，重慶市 400700）

氨茶堿是茶堿與乙二胺的復(fù)合物，藥理作用主要來自于茶堿，是臨床上常用的平喘藥之一[1]。茶堿安全范圍較小，個體差異性大，藥物的相互作用和給藥時間都能影響其體內(nèi)過程，有效濃度與中毒濃度接近。據(jù)文獻報道，目前公認(rèn)血清茶堿治療濃度在10～20μg·mL－1較理想；5μg·mL－1以上有效；＞20μg·mL－1則易出現(xiàn)心動過速、心律失常等不良反應(yīng)[2]；＞35μg·mL－1可發(fā)生發(fā)熱、失水、驚厥等癥狀，嚴(yán)重的甚至引起呼吸、心跳停止致死[1]。所以臨床上常需要監(jiān)測其血藥濃度，以確?；颊哂盟幇踩Ｄ壳氨O(jiān)測氨茶堿血藥濃度常用方法有熒光偏振免疫分析法[3]，但該方法價格較昂貴，同時受抗體試劑盒等限制而無法即時對其血藥濃度監(jiān)測。本試驗采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法進行測定，避免了以上限制，且操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于氨茶堿血藥濃度的監(jiān)測。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀（美國Aglient公司）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A渦旋儀（江蘇國華儀器廠）；BF2000氮氣吹干儀（北京八方世紀(jì)科技有限公司）

1.2 試藥

茶堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國生物制品檢驗所，含量:99.0%，批號:100121-199903）；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:大連依利特BDS C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:甲醇-水（15∶85）；柱溫:35 ℃；流速1mL·min－1；檢測波長:275 nm；進樣量:20μL。

2.2 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取茶堿標(biāo)準(zhǔn)品9.5mg于10mL容量瓶中，用適量雙重蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，配置成濃度為950μg·mL－1的貯備液，置于4℃冰箱備用。另將標(biāo)準(zhǔn)貯備液用甲醇分別稀釋成濃度為42.5、21.25、10.625、5.625、1.105、0.5μg·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃冰箱備用。

2.3 血樣處理

取空白人血清100μL，加入適量的茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入雙重蒸餾水50μL渦旋混勻，再加入乙腈50μL沉淀蛋白，12000 r·min－1離心10min，吸取上清液，置60 ℃水浴中氮氣吹干，殘渣用雙重蒸餾水100μL溶解，取20μL進樣。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血清；B.茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液+空白血清；C.茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液；1.茶堿Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank serum；B.theophylline standard substance+blank serum；C.theophylline standard substance；1.theophylline

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

空白血清中分別加入“2.2“項下系列標(biāo)準(zhǔn)溶液使其終質(zhì)量濃度分別為42.5、21.25、10.625、5.625、0.5μg·mL－1，按照“2.3”項下方法處理，取20μL進樣測定，記錄色譜。以茶堿血藥濃度（X）對峰面積（Y）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝63.115X+12.669（r＝0.9999）。結(jié)果表明氨茶堿血藥濃度在0.5～42.5μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，本方法最低檢測濃度為0.5μg·mL－1（信噪比（S/N）≥3）。

2.5 回收率試驗

取空白血清100μL，配制茶堿濃度分別為42.5、10.625、0.5μg·mL－1，每濃度樣品各5份，按“2.3”項下方法操作測定，根據(jù)測定的茶堿峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到茶堿的濃度，以測得值與實際值之比計算方法回收率[3]。另用“2.2”項下配置好的濃度為42.5、10.625、0.5μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣，以血樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液測得值的峰面積之比計算提取回收率，見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery and precision tests

2.6 精密度試驗

空白血清中分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使之濃度為42.5、10.625、0.5μg·mL－1，每種濃度做5份，按照“2.3”項下方法處理，取20μL進樣。于同日內(nèi)測定5次，并連續(xù)測定5 d，結(jié)果見表1。

3 討論

目前，臨床上常用于監(jiān)測氨茶堿血藥濃度的方法除高效液相色譜法外，還有紫外分光光度法[3]、熒光偏振免疫分析法[4]以及毛細(xì)管電泳法[5]。紫外分光光度法測定氨茶堿的血藥濃度缺點在于干擾較大，靈敏度相對較低，提取過程較復(fù)雜；熒光偏振免疫分析法操作較簡單，但價格昂貴，同時受儀器更新導(dǎo)致無法即時購買相應(yīng)抗體試劑盒等限制；采用高效液相色譜法則可避免上述缺點。據(jù)文獻報道[6]，用高氯酸沉淀蛋白干擾較小，但高氯酸酸性較強，不利于色譜柱的保護。本試驗過程中，筆者嘗試過用甲醇[7，8]沉淀蛋白，但干擾較大；而先用水提取茶堿，再用乙腈沉淀蛋白，氮氣吹干后用水溶解可以消除脂溶性雜質(zhì)干擾。流動相選擇甲醇-水（15∶85）可以使峰形更尖銳，拖尾減少。茶堿屬于堿性物質(zhì)，使用BDS色譜柱更利于堿性物質(zhì)的分離，加保護柱后，保留時間為6.9～7.56min，無雜質(zhì)干擾。本試驗操作過程簡便，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可以作為臨床的茶堿血藥濃度監(jiān)測使用。

[1]黃敬耀主編.藥理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:284.

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[6]楊積平，裕海明.反相高效液相色譜法測定氨茶堿人體血藥濃度[J].安徽醫(yī)藥，2006，10（4）:263.

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