不同色譜柱測定乙酰螺旋霉素原料及其制劑中各組分的含量

楊淑先，王立萍（河南省食品藥品檢驗所，鄭州市 450003）

《中國藥典》2005年版收載的乙酰螺旋霉素組分含量采用高效液相色譜（HPLC）外標法測定，對系統適用性試驗的規定為:“理論板數按單乙酰螺旋霉素Ⅲ組分峰計算應不低于1000；單乙酰螺旋霉素Ⅲ組分峰與雙乙酰螺旋霉素Ⅱ組分峰的分離度應符合要求”[1]。該方法實施以來，發現部分樣品經不同實驗室采用不同的色譜柱會得出不同的測定結果，甚至按照《中國藥典》2005年版的方法和要求進行試驗，分別采用舊批乙酰螺旋霉素標準品（批號:0347-9702，4組分含量:90.2%）和現批乙酰螺旋霉素標準品（批號:130347-200403，4組分含量:78.3%）測定乙酰螺旋霉素原料藥及制劑，結果采用現批標準品比采用舊批標準品對同一樣品的測定結果偏低約4%左右。并且，生產單位也經常為售出的同一批產品組分含量檢查結果與其他實驗室結果有差異而產生分歧。為此，本所、生產單位及相關技術指導部門對其原因進行了系統的分析。經一系列對比試驗之后，發現測定系統對標準品的分離情況對測定結果的影響較大，因此，本所通過考察不同色譜柱的分離效果，以是否達到“標準品的標準圖譜”作為“系統適用性”控制依據，從而使各組分得到良好的分離[2]，使同一樣品采用不同的色譜柱測得的各組分的含量和總組分的含量的結果基本一致。同時，在《中國藥典》2010年版中，對乙酰螺旋霉素及其制劑系統適用性相關內容進行了修訂。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695 HPLC儀、2996二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

乙酰螺旋霉素標準品（批號:130347-200403，4組分含量:78.3%）；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

乙酰螺旋霉素原料及其制劑來源及規格等詳見表1。

表1 樣品來源及規格Tab 1 Source and specifications of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

流動相:乙腈-0.1mol·L－1的醋酸銨溶液（60∶40，用醋酸調節pH值至7.3）；流速:0.8 mL·min－1；柱溫:30 ℃；檢測波長:232 nm。

2.2 分析方法

采用4款C18填料的色譜柱A、B、C、D，規格均為:250 mm×4.6 mm，參照上述色譜條件，對不同批次樣品中各個組分含量進行測定，并考察組分間的分離度和柱效。根據中國藥品生物制品檢定所提供的乙酰螺旋霉素標準品的參考圖譜（批號:130347-200403）進行判斷。標準圖譜見圖1。

圖1 乙酰螺旋霉素標準品圖譜Fig 1 HPLC chromatograms of acetylspiramycin standard

2.3 各組分含量

樣品中4組分含量和組分單Ⅱ＋單Ⅲ、雙Ⅱ＋雙Ⅲ含量測定結果分別見表2、表3、表4（其中采用色譜柱A測定了2次，結果分別記為A1、A2）。

表2 4組分含量測定結果（%）Tab 2 Results of content determination of 4 components（%）

從表2、表3、表4可知:色譜柱A第1次測定結果中，有些數據，比如表1原料中批號為080327、080210260、0802058的結果，超過試驗的誤差范圍，與其他3種色譜柱測定的結果差異較大。通過對比圖譜分析發現，該色譜柱中各組分的保留時間與標準圖譜比較時間有漂移，從而造成差異，因此，組分測定時也應該確保色譜峰保留時間與標準品一致，以減小誤差。

2.4 各組分分離度和柱效

采用不同色譜柱時各組分間的分離度結果見表5、表6（表中“單Ⅱ單Ⅲ”是指單Ⅱ與單Ⅲ間的分離度，其他同理），柱效結果見表7、表8。

從表5、表6、表7、表8可見:要達到良好的分離，即各組分（單Ⅲ與雙Ⅱ、雙Ⅱ與雙Ⅲ之間）雜質的分離個數、雜質的基線分離和4個組分峰后的雜質的個數不但完全一致且完全分離出來，則要求組分間的分離度均遠遠大于液相色譜的系統適用性要求的通用標準（1.5），如果分離度只達到1.5，就達不到上述的良好分離效果，有些雜質峰可能包含在組分峰中而未分離出來；為確保色譜柱的分離效能，要求最終分離的圖譜與標準圖譜對照，應達到標準圖譜的要求或比標準圖譜分離得更好。

表3 組分單Ⅱ+單Ⅲ的含量測定結果（%）Tab 3 Results of content determination of singⅡ+singⅢ（%）

表4 組分雙Ⅱ+雙Ⅲ的含量測定結果（%）Tab 4 Results of content determination of doubleⅡ+doubleⅢ（%）

3 討論

在測定各組分含量時，由于采用色譜柱A第1次試驗時部分數據與其他色譜柱數據差異較大，故再測定了1次。A1部分數據與其他數據有差異的原因是因為保留時間有漂移，而漂移的發生與儀器系統的穩定性有關，其會影響結果的準確性，特別是當測定的批次多、系統運行時間較長時。因此，組分測定時除色譜系統應充分穩定外，還應消除環境溫度變化的影響。本身該品種每次進樣的運行時間較長，也是容易發生漂移的原因之一。因此，進行組分測定計算時，應注意各組分保留時間應與標準品保持一致，否則會影響結果的準確性。

表5 采用A、B色譜柱時各組分間的分離度Tab 5 Separation of the compositions（columnAand B）

表6 采用C、D色譜柱時各組分間的分離度Tab 6 Separation of the compositions（column C and D）

乙酰螺旋霉素組分復雜，組分間小雜質較多，本身在含量測定時就容易存在誤差，如果不能保證足夠的雜質分離，誤差將更大。從本試驗考察的數據可以看出，要達到4個組分之間有足夠的分離度，才能夠保證主組分與雜質的完全分離。本試驗4組分的柱效都達到10000以上，且組分間的分離度超過8.0，因此對色譜柱的性能要求較高。如果按照2005年版《中國藥典》只要求常規的分離度1.5即可，那么，標準品就可能不能分離出單Ⅲ與雙Ⅱ之間的4個雜質峰，4個雜質峰也可能達不到基線分離。

由于乙酰螺旋霉素成分的復雜性，為便于標準品和供試品在測定過程中的組分定位以及判斷各組分之間的分離狀況，《中國藥典》2010年版已將該項下的系統適用性規定為“記錄的色譜圖應與標準圖譜一致”[2]，只有分離情況（各組分之間分離雜質的個數、雜質基線分離等）與標準圖譜一致時，才能夠進行組分含量測定，以減少不同分離狀態（比如組分之間的雜質分離個數不同及主組分峰最后的雜質峰未分離完全等）造成的結果誤差，特別是在組分邊緣時易造成對結果的誤判。

表7 采用A、B色譜柱時各組分的柱效Tab 7 Column efficiency of the compositions（column A and B）

表8 采用C、D色譜柱時各組分的柱效Tab 8 Column efficiency of the compositions（column C and D）

與標準圖譜對照時，應注意組分間雜質的個數及雙Ⅲ峰后雜質的檢出是否完全，否則會影響后一次進樣的雜質判斷。

由于2005年版《中國藥典》的系統適用性要求中，未要求檢測時與標準圖譜對比，這樣導致對同一批樣品測定時，由于分離情況的差異，出現不同的測定結果，因此，需要對其進行修訂及完善。

2010年版《中國藥典》已對該內容進行了修訂，即與標準圖譜對照一致就是該品種2010年版《中國藥典》執行的一個統一的分離衡量標準。這樣，除了試驗本身存在的誤差之外，同一批次樣品在不同實驗室測定應該都能反映其真實含量。本試驗為2010年版《中國藥典》乙酰螺旋霉素及其制劑的修訂方法執行提供了借鑒和依據。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京:化學工業出版社，2005:6.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:8.