丹參、紅花分提和合提提取液的指紋圖譜比較

王小平，劉 峰，韓 翠，馬存德

(1．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046;2．陜西步長制藥有限公司，陜西 咸陽 712000)

中藥復(fù)方制劑在提取過程中，由于各藥味的化學(xué)成分相互影響，產(chǎn)生助溶、化學(xué)反應(yīng)等現(xiàn)象，使中藥復(fù)方制劑中提取的有效成分發(fā)生變化，直接影響中藥復(fù)方制劑的臨床療效。因此，研究中藥復(fù)方制劑有效成分的變化是中藥復(fù)方研究的一個重要內(nèi)容[1]。丹紅注射液 (國藥準字Z20026866)具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)功能，用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)、冠心病、心絞痛，心肌梗塞等癥。復(fù)方配伍由于藥物間的相互作用使得化學(xué)成分更加復(fù)雜多變，用某一種或幾種化學(xué)成分的含量難以全面評價復(fù)方的制備工藝，而指紋圖譜在中藥或中成藥的研究和應(yīng)用越來越廣泛[2－4]。因此，筆者采用指紋圖譜技術(shù)，分析、比較丹參和紅花分提和合提兩種提取液，探討兩藥不同提取方法所得提取液化學(xué)組成成分的差異。旨在為丹紅注射液的工藝改進提供理論依據(jù)。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器與材料

戴安UitiMate 3000全自動高效液相色譜儀，泵:UitiMate 3000;自動進樣器:UitiMate 3000;檢測器:UitiMate 3000UV檢測器。工作站:Chromeleon。UV756紫外可見分光光度計 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)。Discovery DV215CD型雙量程電子分析天平 (瑞士;0.01mg;0.1mg)

1.2 試藥

羥基紅花黃色素A(111637－200503)、丹參素鈉對照品 (110855－200405)、丹酚酸B對照品(111562－200807)均由中國藥品生物制品檢定所提供。原兒茶醛均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中藥現(xiàn)代化研究中心提供。流動相所用甲醇、乙腈為色譜醇，其他試劑如:磷酸等均為分析純;丹參、紅花來自山東菏澤步長制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:迪馬公司Diamonsil(鉆石)C18色譜柱 (4.6mm×250mm，5μm);流動相:甲醇－乙腈－0.4%的磷酸水，梯度洗脫;流速:1.0mL/min，檢測波長:377 nm，柱溫:25℃;進樣量:15μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛對照品適量，用甲醇溶解并稀釋，制成每1mL溶液含羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛分別為0.2mg．

表1 梯度變化表

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 丹參和紅花合提

取丹參藥材飲片3份:紅花藥材1份(為丹紅注射液處方組成的比例)，兩藥合并，加水10倍量，提取3次，每次0.5h，過濾，合并濾液，備用。

2.3.2 丹參、紅花分別提取

取與“2.3.1”項下相同量的藥材，分別加水10倍量，提取3次，每次0.5h，過濾，濾液合并，備用。

2.4 精密度試驗

取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣5次，用MATLAB軟件計算相似度，在同一儀器測得的色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度分別為0.9925，0.9956，0.9943，0.9928，0.9964，滿足相似度不小于0.950，并考察色譜峰保留時間和峰面積的一致性，羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛保留時間RSD和峰面積的RSD均小于1.9%．

2.5 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別于0，1.5，3，6，8，12 h進樣檢測，直觀觀察指紋圖譜的全貌無明顯變化，用MATLAB軟件計算相似度，在同一儀器測得的色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度分別為0.9971，0.9948，0.9906，0.9925，0.9916，滿足相似度不小于0.950，并考察保留時間和峰面積的一致性，羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛保留時間RSD和峰面積的RSD均小于1.8%，表明在此時間內(nèi)供試品溶液中的上述成分是穩(wěn)定的。

2.6 重復(fù)性試驗

分別取同一丹參藥材飲片、紅花藥材樣品6份，制備供試品溶液，分別注入液相色譜儀測定，所得色譜指紋圖譜直觀觀察，表明指紋圖譜的全貌無明顯變化，用MATLAB軟件計算相似度，在同一儀器測得的色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的 相 似 度 分 別 為 0.9927，0.9935，0.9956，0.9918，0.9938，0.9959，均大于0.95，并考察保留時間和峰面積的一致性，羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛保留時間RSD和峰面積的RSD均小于1.9%．

2.7 樣品測定

分別精密吸取上述供試品溶液適量，置10mL量瓶中，用水稀釋到刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，精密吸取10μL注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。對不同批次HPLC色譜圖進行解析，確定共有峰，構(gòu)建樣品的HPLC色譜圖的指紋特征。采用MATLAB軟件對各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)進行分析，以6批樣品生成的對照譜圖作為對照模版，計算各色譜圖的整體相似度，6批樣品相似度分別為 0.9905，0.9934，0.9897，0.9934，0.9964，0.9985。精密吸取羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛對照品溶液與供試品溶液各10uL，分別進樣測定，確定指紋色譜圖中的6號峰為羥基紅花黃色素A，9號峰為丹參素，10號峰為原兒茶醛，14號峰為丹酚酸B。

2.8 結(jié)果

丹參和紅花不同提取方法所得提取液共有模式指紋圖譜見圖1。從整體角度判斷，以兩藥合提所得提取液指紋圖譜中的主要色譜峰為基準，與兩藥分別提取再合并所得提取液的圖譜做比較，發(fā)現(xiàn)兩藥分提與合提的指紋圖譜中主要色譜峰數(shù)目一致，保留時間基本相同，峰面積基本相等。初步斷定丹參、紅花分提與合提，其主要化學(xué)成分沒有發(fā)生變化。

3 討論

采用UV檢測器對指紋圖譜的檢測波長進行選擇，結(jié)果表明，檢測波長377nm處，所得各色譜峰具有代表性，信息量較大，各色譜分離度好。故選用377nm為檢測波長。采用不同的洗脫系統(tǒng)對流動相的組成進行優(yōu)化，最終選用2.1項下的流動相組成進行梯度洗脫，各色譜分離度好，基線平穩(wěn)。本文比較了Kromasil C18100－5(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱和迪馬公司 Diamonsil(鉆石)C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，從指紋圖譜整體信息比較來看，Kromasil柱所得圖譜和Diamonsil柱所得圖譜的差異不大，色譜的整體性相似。從戴安UitiMate 3000高效液相色譜儀和美國Agilent－1100型高效液相色譜儀所得指紋圖譜的整體性和模糊性上來看，整體信息基本相似，說明指紋圖譜在不同儀器上的“相似性”。故本文的HPLC指紋圖譜在不同型號儀器和不同色譜柱上具有良好的重現(xiàn)性。

圖1 丹參紅花合提和分提所得提取液共有模式圖譜

從本實驗結(jié)果可以看出，丹參、紅花 (按3∶1的比例)兩藥分別提取后，再將提取液合并與兩藥合提的主要化學(xué)成分的種類和峰面積基本一致。這說明丹參、紅花兩藥分別提取后，將提取液合并與兩藥合提對主要化學(xué)成分的種類和含量幾乎沒有影響。

[1]曹佩雪，梁光義，李霞，等．葛根芩連湯不同配伍情況下葛根素、黃芩苷、小檗堿的含量比較 [J]．中國醫(yī)藥學(xué)報，2003，18(8):459－462．

[2]李欣，尹蓮，段金廒．二妙丸類方抗?jié)駸嶙C痛風(fēng)有效部位群指紋圖譜比較研究 [J]．中國中藥雜志，2008，33(16):1971－1975．

[3]武榮蘭，徐世美，封順．液相色譜指紋圖譜在當歸、黃芪及其復(fù)方有效成分分析中的應(yīng)用[J]．分析試驗室，2007，26(10):93－96．

[4]羅毅，楊俊，張倩睿．配伍黃芪對淫羊藿主要化學(xué)成分的影響 [J]．中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13(12):46－48．