鞘內注射螺內酯對大鼠神經根痛的影響

彭良玉，顧小萍，馬 擎，朱蓓蓓，宋麗華，孫曉鳳，馬正良

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院麻醉科，江蘇南京 210008)

神經根性腰腿痛以痛覺過敏及痛覺超敏為特征，至今仍是臨床難以解決的棘手問題。以往研究提示神經損傷后，促炎介質，如:IL-1β、TNF-α和IL-6在神經病理性疼痛的發展和形成過程中起著重要的作用［1］。核轉錄因子(nuclear factor κB，NF-κB)在促炎介質的產生及中樞敏化的形成中起著重要的調控作用［2］。NF-κB是由Rel蛋白家族形成的同二聚體或異二聚體，其中p65/p50異二聚體是其最常見類型。螺內酯是鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)拮抗劑，通過拮抗鹽皮質激素受體可以抑制 NF-κB的活化，減少促炎介質的產生［3］。已知MR在脊髓背角的第2版層有較高的表達［4］，提示其在疼痛中可能起著重要的調節作用。但對脊髓水平MR在神經病理性疼痛中的作用尚未見相關的研究報道。本試驗擬通過鞘內注射螺內酯觀察其對注射式慢性背根神經節壓迫模型大鼠疼痛行為和脊髓背角中磷酸化的p65(p-p65)的表達變化，探討螺內酯對神經根痛的作用及其機制。所選螺內酯劑量被認為可以完全阻斷MR的作用［5］;

1 材料與方法

1.1動物、試劑及儀器SPF級♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量280～320 g，分籠飼養，室溫24℃～25℃，光照每日8:00～20:00。嚴格遵守南京大學動物保護和使用規定。螺內酯(1 g/瓶，生產批號:S3378，Sigma公司，美國)，von Frey纖毛(Stoelting公司，美國)，ME410C型全自動熱輻射刺激儀(中國醫學科學院生物醫學工程研究所)。β-actin一抗(生產批號:KGAA001)，p65(phoshpo-Ser536)一抗(生產批號:KG11014)和二抗(羊抗兔，生產批號:KGAA35)均購至南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2鞘內置管、給藥和分組SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉后按 Yaksh等［6］的方法自枕骨大孔處行蛛網膜下腔置管，置入微細導管(PE-10)至腰髓平面(～8.5 cm)，有運動障礙的動物棄去不用。在大鼠鞘內置管成功后的d 5，77只SD大鼠隨機分為假手術組(Sham，n=27)，溶劑對照組(CCD，n=27)和螺內酯組(Spir，n=23)，CCD組和Sham組隨機挑選12只，Spir組隨機挑選8只用于行為學測試，每組余下大鼠再隨機平均分配到3個時間點(CCD術后d 4、d 7、d 10)用于蛋白檢測。螺內酯溶于10%酒精中，通過植入的PE10導管給予。Spir組于CCD術后d 2～4，每次鞘內給予3 μg/10 μl，每天 2 次。給藥后予 10 μl生理鹽水沖洗。Sham組及CCD組則每次給予等10%酒精10 μl，后用 10 μl生理鹽水沖洗。

1.3CCD模型建立大鼠慢性背根神經節壓迫疼痛模型(CCD)采用前期研究描述的方法建立［7］。腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉后，制模組于大鼠背部正中L4～6部位切開皮膚，分離脊柱右側肌肉，暴露乳狀突與橫突，從L5椎間孔用不銹鋼的22-G頓頭針以與中線呈30°～40°，與水平線呈10°～15°的角度向上緩慢置入約4 mm，見右下肢出現抽搐時再稍微往后退，然后緩慢注入60 μl SURGIFLOTM。注射時常可以看到右下肢出現1～2次抽搐。注射完SURGIFLOTM后，用6.0的尼龍縫線逐層縫合肌肉和皮膚。Sham組則重復上述過程，但是不注入SURGIFLOTM。上述手術過程均在無菌條件下進行，并于術前2 h及術后d 1～2，腹腔給予頭孢呋辛鈉4 mg。

1.4行為學測試制模前3 d，將SD大鼠置于測行為學的試驗箱中適應環境，每天1 h。并于術前1 d測定基礎值。每次測量行為前將大鼠置于試驗箱中適應0.5 h。根據Tal等［8］報道的方法進行痛覺超敏(allodynia)測試。大鼠置于20 cm×20 cm×25 cm的透明有機玻璃箱內，放置于30 cm高的鐵絲網(網格1 cm×1 cm)架子上，大鼠于其中自由活動。約30 min待大鼠安靜后以不同折力的von-Frey纖毛刺激大鼠足底(最大值設為15 g)，持續6～8 s。大鼠后肢出現迅速畏縮、撤回，認為是陽性反應。將出現3次以上陽性反應的最小von-Frey纖維強度定為大鼠的機械刺激回縮閾值。兩次刺激之間間隔約15 s。熱敏采用Hargreaves等［9］所描述的方法進行檢測。將大鼠置于底部為3 cm厚玻璃板的20 cm×20 cm×25 cm的透明有機玻璃箱內，用全自動熱輻射刺激儀檢測。初次使用前，調節熱輻射刺激儀焦距和光強度，使術前大鼠基礎縮腿閾值在12～20 s左右。光透過玻璃板照射于大鼠后足，當后肢出現特征性甩動、提足或舔舐時，切斷光源，記錄時間。每只大鼠測試5次，去掉最大和最小的2個值，取余下的3個數值的平均值為評估熱痛敏的縮腿閾值。兩次刺激間至少間隔5 min。預先設定輻射光源自動切斷時間為20 s，避免長時間照射造成大鼠灼傷。

1.5蛋白印跡麻醉后采用斷頭術迅速處死大鼠，取出腰段脊髓。分離出脊髓背角，并將左右分開。提取蛋白-80℃凍存。BCA法測蛋白濃度。按照每4 μl蛋白樣品加入1 μl SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)比例混合，煮沸5 min。上樣80 μg至8%SDS-PAGE電泳，分離后將蛋白質電轉移到PVDF上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(pp65，1 ∶500稀釋;β-actin 1 ∶500稀釋)，4℃孵育過夜，TBST漂洗，5 min×3次，加入二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋)，室溫振蕩孵育2 h，TBST漂洗，5 min×3次，ECL化學發光液作用1 min，壓片、顯影和定影。結果采用Adobe Photoshop CS2軟件分析，以目的蛋白除以β-actin內參條帶的IOD值作為最終結果進行統計分析。

1.6統計學分析應用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。數據以±s表示，采用重復測量的方差分析以檢驗各組間及各組內各時間點間的差異。當差異存在時，用post hoc Newman-Keuls檢驗進行兩兩比較。

2 結果

2.1鞘內注射螺內酯明顯改善機械痛覺超敏和熱輻射痛覺過敏用SURGIFLOTM壓迫大鼠背根神經節后，從術后d 1～14，CCD組受壓側縮足機械痛覺超敏閾值(PWMT)和熱敏潛伏期(PWTL)明顯降低(P＜0.01)，而Sham組和對側都沒有明顯變化。在CCD術后d 2～4，每次鞘內注射3 μg螺內酯，每天2次。在術后d 4、d 7，與CCD組相比，螺內酯明顯提高大鼠受壓側PWMT(Fig 1A，d 4:11.58±1.38vs7.71±0.82，P＜0.01;d 7，10.89 ±1.46vs7.49 ±1.11，P＜0.01)和 PWTL(Fig 1B，d 4:14.14±1.52vs8.19±1.32，P＜0.01;d 7，13.56±1.63vs8.56±1.56，P＜0.01)在此模型上顯示出鎮痛作用;在d 10、d 14，Spir組PWMT和PWTL與CCD組無差異，說明藥物作用已消失，而對側的疼痛行為學則無變化。結果見Fig 1。

2.2鞘內注射螺內酯可以明顯抑制受壓側腰段脊髓背角中NF-κB的活化在慢性壓迫背根神經節后，與Sham比，CCD組受壓側脊髓背角中p-p65明顯升高(Fig 2A、B，P＜0.01)。對側則沒有明顯變化。鞘內注射螺內酯后，與CCD組相比，p-p65的表達則明顯降低(Fig 2A、C，P＜0.05)。并且這一作用持續到術后d 7，與行為學相一致。

3 討論

MR在脊髓背角第2版層神經元中明顯表達［4］，提示其可能在調節疼痛信號傳遞中起著重要的作用。已有研究提示［10］MR-NF-κB 信號通路參與了多個臟器的病變過程，抑制其活化可以起到臟器保護作用。許多前期研究都表明［11-13］，MR在突觸的重塑中發揮著重要的作用。MR是否參與了脊髓水平突觸的重塑從而調節神經病理性疼痛還需要進一步的研究探討。

Fig 1 Effects of intrathecal administration of spironolactone on pain behaviors

NF-κB是由Rel蛋白家族組成的同二聚體或異二聚體，其在免疫反應、炎性疾病和細胞死亡中都起著重要的作用。由于NF-κB可以調節多種炎癥以及疼痛相關蛋白的表達，其在疼痛中的作用逐漸被認識。特異性抑制脊髓背角中膠質細胞NF-κB活化，可以明顯緩解坐骨神經損傷誘導的異常疼痛和痛覺過敏癥狀并抑制IL-6和一氧化氮合酶的上調［14］;鞘內注射NF-κB抑制劑可以緩解外周炎癥誘導的疼痛及藥物誘導的中樞性疼痛［2，15］。前期的研究中也發現，CCD 術后，NF-κB 活化標志物IκB-α 表達明顯升高，硬膜外給予醋酸潑尼松龍則可以明顯緩解神經病理性疼痛［7］。本研究進一步證實:在壓迫背根神經節后，同側脊髓背角中 NF-κB明顯激活，用螺內酯抑制NF-κB的激活則可以明顯緩解疼痛癥狀。IκB-α恢復正常后，鞘內給于醋酸潑尼松龍則參與了疼痛的維持［7，16］。而在外周神經結扎誘導的大鼠神經病理性疼痛模型，脊髓背角中NF-κB表達是明顯下調的［17］，鞘內注射糖皮質激素不能緩解疼痛反而明顯加劇疼痛癥狀［18］。這些結果進一步證實了螺內酯通過抑制MR-NF-κB信號通路而起到鎮痛的作用。

Fig 2 Intrathecal injection of spironolactone inhibited upregulation of phosphorylated p65(p-p65)following chronic compression of the dorsal root ganglia

但Wang等［18］在其另一項研究中發現，鞘內注射螺內酯對外周神經損傷誘發的神經病理性疼痛沒有影響。這可能與不同的研究模型有關。前期的研究也表明，腹腔注射螺內酯對不同的疼痛模型的作用不一致，甚至是相反的［19］。神經損傷模型誘發的神經病理性疼痛則因神經損傷部位不同而對藥物處理的反應也不相同［20］。

綜上所述，脊髓水平MR在神經病理性疼痛的發生和發展過程中起著重要的作用。MR-NF-κB信號通路是其誘導中樞敏化的重要的機制之一。MR抑制劑螺內酯可以明顯抑制疼痛行為及脊髓背角中NF-κB的活化。這為我們臨床治療神經病理性疼痛提供了新的思路，但其用于臨床還需要進一步的研究。

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