miR-143對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響以及對Bcl-2表達的調節

劉立鵬，于瀟華，王曉春，郭小芳，田 智，龍 昱，粟 敏，羅玥佶，黃春霞，胡桔紅，吳新華，宋元達

(1.長沙醫學院生化教研室，湖南長沙 410219;2.中南大學湘雅醫學院醫學檢驗系，3.中南大學湘雅醫學院婦產科，湖南長沙 410013;4.中南大學生命科學與技術學院生化系，湖南長沙 410013)

microRNAs是一類非編碼的小分子RNA，越來越多的證據證明microRNAs在細胞增殖或凋亡［1］、細胞分化［2］、生殖［3］以及腫瘤發病機制［4］中都具有一定的調控作用。越來越多的實驗證明，在腫瘤的發生發展中存在著特異性表達的microRNAs，并且其中的一些microRNAs參與調控了腫瘤的發生與發展。

宮頸癌是全球高發的女性惡性腫瘤之一，但目前我們對宮頸癌的發病機制尚缺乏全面和深入的了解。最新的研究發現，microRNAs在腫瘤［5］、心血管［6］、糖尿?。?］等多種疾病中發揮重要的作用，其機制可能與某些microRNAs調控的疾病相關基因表達有關。通過 PICTAR5、PICTAR4、PITA、RNA22、TargetScan等軟件，我們查到Bcl-2是miR-143的預測靶位點，為進一步研究 miR-143在癌癥發生發展中的作用，本實驗通過構建miR-143和anti-miR-143高表達質粒，用脂質體將該質粒轉染宮頸癌HeLa細胞，檢測細胞中Bcl-2蛋白和mRNA表達情況，并觀察HeLa細胞增殖和凋亡的變化情況，雙熒光素酶報告基因法檢測miR-143的靶位點。

1 材料與方法

1.1材料胎牛、小牛血清，杭州四季青生物有限公司;RPMI1640細胞培養基，美國Gibco公司;HeLa細胞，中國醫學科學院基礎醫學研究所;質粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;總RNA提取試劑盒(TRzol法)，Invitrogen公司;RT試劑盒，美國MBI公司;PCR試劑盒，天根生化科技有限公司;LipofectamineTM2000轉染試劑盒，Invitrogen公司;嘌呤霉素，Sigma公司;引物合成，上海生工有限公司;載體 miRNASelectTMpEGP-miR，miRNASelectTMpEP-miR vector，美國 Cell Biolabs公司;Bcl-2 抗體，Santa Cruze;細胞凋亡 ELISA檢測試劑盒，Roche公司;Taq Man MicroRNA Assays，ABI公司;Dual-luciferase reporter gene system，Promega公司;pMIR-REPORT載體，Ambion公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養、pre-miR-143以及pre-anti-miR-143質粒的構建與轉染 HeLa細胞培養于添加體積分數為10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，37℃，5%CO2孵箱中培養。根據miR-143的前體序列，DNA合成技術得到第一鏈DNA，接著通過PCR擴增得到雙鏈DNA，插入載體miRNASelectTMpEGP-miR，鑒定構建質粒，隨后轉化E.coliDH5α宿主菌。體外合成的anti-miR-143前體序列以及對照組miRNA，也用同樣方法插入載體，轉化到大腸桿菌中。用10%胎牛血清RPMI1640培養基培養HeLa細胞24 h，換為優化培養基，并加入配好的脂質復合體，5 h后換成10%胎牛血清RPMI1640培養基。待轉染48 h后加入嘌呤霉素篩選陽性克隆。qRT-PCR檢測miR-143的表達情況，根據ABI公司提供的Taq Man MicroRNA Assays試劑盒中的說明書，利用試劑盒中miR-143和U6 RNA特異性頸環結構引物檢測細胞中成熟的miR-143，ABI7300實時PCR檢測系統進行分析，U6 RNA作為內參。

1.2.2MTT法檢測細胞的增殖 取對數生長期的HeLa細胞，以每孔2×103個細胞接種于96孔培養板中。待細胞長到50%融合時更換為無血清的RPMI1640培養基，進行細胞周期同步化24 h，后加10%胎牛血清，在12 h，24 h，48 h分別加入10×MTT，繼續培養4 h，用Elx-800酶聯免疫檢測儀測定570 nm吸光度值。

1.2.3ELISA檢測細胞凋亡 將pre-miR-143，preanti-miR-143以及對照miRNA組的高表達質粒瞬時轉染到HeLa細胞中，分別培養12、24、48 h后，按細胞凋亡ELISA檢測試劑盒的說明提取細胞質組蛋白/DNA片段，加入組蛋白抗體包被的酶標板與之免疫雜交1 h，清洗去除未雜交的溶液后加入辣根過氧化物酶偶聯的DNA抗體與之結合1 h，清洗去除未結合的溶液后加入過氧化物酶底物溶液反應30 min，加入1 mol·L-1H2SO4中止反應，酶標儀405 nm測吸光度。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，定量，與上樣緩沖液按比例混勻，100℃煮5 min，8%SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。加入二抗，37℃孵育45 min，TBST洗滌3次，每次15 min，在暗室中壓片，然后顯影、定影。

1.2.5RT-PCR檢測mRNA表達 分別提取總RNA，定量后進行逆轉錄聚合酶鏈反應，以β-actin為內參，上游引物序列為5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3'，上游引物序列為5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，擴增長度為480 bp，其PCR條件:94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸40 s，30個循環后再72℃終末延伸5 min;Bcl-2的上游引物序列5'-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3'，下游引物序列為 5'-CCGCTAGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3'，擴增長度為 318 bp，PCR條件:94℃預變性3 min，94℃變性30 s、57.9℃退火30 s、72℃延伸1 min，30個循環后再 72℃延伸5 min。取產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6雙螢光素酶報告基因 將Bcl-2 3'UTR中與miR-143結合的預測靶位點序列(CAUCUCA)進行點突變，將A突變成G，將其插入pMIR-REPORT載體，構建pMIR-Bcl-2-mut質粒。同樣將Bcl-2 3'UTR插入pMIR-REPORT載體，構建pMIR-Bcl-2質粒。在24孔板中接種細胞，將 pMIR-Bcl-2，pMIRBcl-2-mut或者pMIR-REPORT連同 pre-miR-143或者對照miRNA組高表達質粒一同轉染到HeLa細胞中，載有海腎熒光素酶的pRL-TK載體也被轉染到細胞中作為對照。培養24 h后細胞裂解，取50 μl的熒光素酶測試試劑Ⅱ(LARⅡ)10 μl的細胞裂解液在測量管中混勻，放入螢光儀中測量螢火蟲螢光素酶的活力，隨后加入50 μl Stop＆Glo Reagent，吹打混勻，測量海腎螢光素酶的活力，利用Turner Designs，Spreadsheet Interface Version 2.0.1 進行計算分析。

1.2.7統計學方法 所有實驗重復3次，所得數據以±s表示，數據處理用SPSS 16.0統計軟件，組間顯著性檢驗采用方差分析。

2 結果

2.1MTT檢測細胞增殖qRT-PCR結果顯示質粒轉染成功，并且穩定表達(Fig 1A)。MTT試驗如Fig 1B所示，轉染了miR-143高表達質粒的HeLa細胞的增殖情況受到抑制，而轉染了anti-miR-143的HeLa細胞增殖情況受到促進，并且在24 h之后出現明顯變化，與對照miRNA組相比，轉染了miR-143的HeLa細胞，在24 h和48 h其增殖抑制率分別降低了13.54%、18.63%;而轉染了anti-miR-143的HeLa細胞分別增加了9.38%、13.66%。實驗結果表明miR-143抑制HeLa細胞增殖。

2.2ELISA法檢測細胞凋亡ELISA檢測細胞凋亡，如Fig 2所示，相對于對照miRNA組，miR-143促進細胞凋亡，并且在24 h之后產生明顯的促凋亡作用，而anti-miR-143能夠削弱這種促凋亡作用，實驗結果提示miR-143促進HeLa細胞凋亡。

2.3miR-143對Bcl-2蛋白表達的影響Western blot檢測細胞中Bcl-2蛋白表達水平，結果顯示(Fig 3):與control miRNA組相比，轉染了miR-143高表達質粒的HeLa細胞中Bcl-2蛋白明顯減少，降低了21.31%，而轉染了anti-miR-143的HeLa細胞組中，Bcl-2蛋白升高了22.71%。結果提示在HeLa細胞中，過表達的miR-143降低Bcl-2蛋白的表達，而anti-miR-143能夠減弱這種抑制作用。

2.4miR-143對Bcl-2 mRNA表達的影響RTPCR結果顯示(Fig 4)，與對照組相比，轉染了premiR-143高表達質粒的HeLa細胞組中，Bcl-2mRNA表達水平改變很小，并且轉染了pre-anti-miR-143的HeLa細胞組中Bcl-2 mRNA的表達差異也無統計學意義。結果表明miR-143不影響Bcl-2 mRNA的表達。

Fig 1 Effect of MiR-143 on HeLa cell proliferation in vitro

Fig 2 Detection of HeLa cell apoptosis by ELISA

Fig 3 Detection of Bcl-2 protein expression by Western blot

Fig 4 Detection of Bcl-2 mRNA expression by RT-PCR

Fig 5 Detection of the target sites of miR-143 by dual-luciferase reporter gene assay

2.5miR-143打靶Bcl-2 3'UTR序列雙螢光素酶報告基因分析結果顯示，相對于對照miRNA組，轉染了pre-miR-143和pMIR-Bcl-2高表達質粒的HeLa細胞熒光素酶的活性明顯降低，然而在含有pMIR-Bcl-2-mut和 pre-miR-143的HeLa細胞中，熒光素酶的活性的變化不大。實驗結果提示，Bcl-2可能是miR-143的一個靶位點。

3 討論

現有研究證明，microRNAs的異常表達參與宮頸癌的發生與發展。本文通過實驗發現miR-143抑制HeLa細胞的增殖，促進凋亡;miR-143在HeLa細胞中對Bcl-2蛋白具有明顯的調節作用，而antimiR-143則促進Bcl-2蛋白的表達;進一步的研究證實，miR-143對HeLa細胞增殖和凋亡的影響，至少部分是通過打靶Bcl-2 3'UTR實現的。

miR-143是最近研究比較多的一種microRNAs，研究表明其在腫瘤發生中具有一定的調節作用。最新研究發現，miR-143 在結腸癌［8］，肺癌［9］，前列腺癌［10］中低表達，在肝癌［11］中高表達。其中在前列腺癌中 miR-143參與調節 MYO6的表達［10］，ERK5是miR-143的一個直接靶位點，miR-143通過打靶ERK5抑制細胞增殖［12］。在結腸癌中，miR-143的高表達降低細胞增殖和克隆形成的能力，并且DNMT3A是miR-143的一個直接作用靶點，miR-143調節DNMT3A的表達［13］。近年來研究結果顯示，microRNAs在宮頸癌中具有一定的調節作用。Cheng等［14］發現miR-218能夠抑制 HeLa細胞的增殖，并且誘導細胞凋亡。在 HeLa細胞系中，過表達的miR-214能夠明顯抑制細胞增殖，并且穩定過表達miR-214的HeLa細胞系中，miR-214下調MEK3和JNK1蛋白和mRNA的表達。進一步的研究表明，miR-214通過打靶MEK3和JNK1的3'端非翻譯區抑制其表達，實驗結果提示miR-214可能通過打靶MEK3和JNK1 mRNA的非編碼區抑制HeLa細胞的增殖［15］。本實驗發現，miR-143對 HeLa細胞具有調節作用，miR-143能夠抑制HeLa細胞的增殖，促進HeLa細胞凋亡，結合其他實驗發現miR-143在很多種腫瘤中差異性表達，提示miR-143有可能成為腫瘤診斷、治療及預后的新靶標。

Bcl-2是凋亡相關蛋白，Bcl-2過度表達與多種上皮性腫瘤的發生發展密切相關，可導致DNA受損的細胞持續生存、突變產物聚集。有研究發現［16］，Bcl-2蛋白的表達與宮頸癌擴散的發展直接相關，并且Bcl-2的表達與子宮頸上皮內瘤的臨床分期直接相關［17］。目前，有研究也發現，很多 microRNAs調控Bcl-2的表達，例如，miR-181a通過打靶Bcl-2增加人惡性膠質瘤的輻射敏感度［18］;miR-29可能通過Mcl-1和Bcl-2參與的線粒體途徑促進肝癌細胞凋亡［19］;miR-15b和miR-16至少部分通過打靶Bcl-2調控細胞凋亡，從而在胃癌多藥耐藥的發展中發揮著重要的作用［20］。在我們的研究中，我們發現過表達的miR-143明顯降低Bcl-2蛋白表達，但對Bcl-2 mRNA的影響較小，然而轉染anti-miR-143則明顯增加Bcl-2蛋白的表達。為了進一步驗證miR-143，Bcl-2與HeLa細胞增殖及凋亡的關系，我們利用雙螢光素酶報告基因分析法驗證了miR-143至少部分通過打靶Bcl-2 3'UTR并抑制其蛋白質表達，影響HeLa細胞增殖和凋亡。

本實驗我們發現miR-143至少部分通過打靶Bcl-2抑制 HeLa細胞增殖，并且促進凋亡，結合miR-143和Bcl-2的其他研究，我們可以發現，miR-143至少是某些腫瘤發生過程中活性較強的microRNAs，miR-143的差異性表達能夠影響不同的蛋白質，同時Bcl-2也可以與不同的microRNAs產生相互的作用，進而影響體內的生理病理過程，我們的實驗再一次驗證了microRNAs與蛋白質表達之間的多重對應的關系，該結果提示體內的microRNAs可能存在一個網絡式結構，與其反式作用因子共同調節各種生理過程。本實驗的結果為我們進一步研究探索microRNA對腫瘤的調節作用及其臨床治療提供了理論依據。

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