雙孢蘑菇菌種液氮保種方法的研究*

李洪榮

（福建農業科學院食用菌研究所，福建 福州 350014）

菌種保藏的目的是保持菌種高產優質的優良性狀，盡量減少或降低菌種的衰退速度和死亡率，使菌種保證統一和不被污染，能夠長期或較長期地在生產中應用。因此菌種保藏工作是我所遺傳育種研究室長期研究的課題。菌種保藏的基本原理是采用低溫干燥、真空隔氧的方法，來控制菌絲的繁殖和減慢菌絲代謝的速度，使它處于休眠和半休眠狀態，常用的保種方法有低溫斜面保藏、液體石蠟法保藏、硅膠保藏、冷凍干燥保藏、蒸餾水保藏和液氮超低溫保藏方法等，其中液氮保藏方法經過30年來的研究證實是一種最穩定、長效的微生物菌種保藏手段，蘑菇菌種的液氮保藏方法研究最早在美國模式菌種庫ATCC和賓州大學進行，Hwang于 1972年應用超低溫技術保藏蘑菇菌種的初步結果表明是有希望的[1]，隨后San Antonio于1978年報道了應用液氮成功地保藏蘑菇菌種達9年之久，其生存能力和蘑菇產量不受影響[2]。

Jodon等也報道了8個商業栽培雙孢蘑菇品種液氮保藏10年后，沒有明顯的形態和生理特性的變化[3]。英國溫室作物研究所Challen MP等對蘑菇菌種的保藏進行了系統的研究，認為液氮可長期保存蘑菇菌種，并于1986年發表了液氮菌種使用聚丙烯吸管安瓿的保藏容器的改進。我國中科院微生物研究所陳燕妍，于1987年進行了擔子菌菌種24屬43種122株的液氮超低溫保藏的研究，結果表明不同冷凍保護劑對菌株存活率有很大的影響，冷凍的快慢、解凍的快慢也是影響菌株存活率的主要因素之一[5]。Suman BC、Sobieralski K等報道雙孢蘑菇菌種經過液氮保藏后，蘑菇菌絲生長速度及產量均不會受到影響[6，7]。本文對雙孢蘑菇菌種的液氮保藏方法進行了系統研究，并經過成活率測定及出菇栽培的驗證，以其獲得雙孢蘑菇菌種液氮保藏的有效方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

雙孢蘑菇菌株As2796、As4607，由福建省農科院食用菌研究所種質資源與遺傳育種研究室保藏提供。

1.1.2 液氮保藏的基質

PDA、小麥、小米等。

1.1.3 冷凍保護劑

5%、10%甘油，5%、10%二甲亞砜。

1.1.4 安瓿管

聚丙烯吸管安瓿管。

1.2 方法

1.2.1 冷凍方法

極速冷凍，即直接把裝有菌種的安瓿管從室溫放入液氮中保藏；慢速冷凍，即把裝有菌種的安瓿管先在液氮罐口預冷，緩慢地從上往下降，大約30 min后，安瓿管溫度降至－40℃時，再把安瓿管浸入液氮。

1.2.2 解凍方法

極速解凍，即從液氮中取出的安瓿管直接放入38℃的溫水中快速解凍；慢速解凍，即從液氮中取出的安瓿管放在室溫條件下緩慢解凍。

1.2.3 存活率計算

經液氮保藏的菌種，取出解凍活化后移接至PDA培養基上正常培養，計算正常萌發的接種塊占總移接接種塊的比率。

1.2.4 出菇試驗

按福建省蘑菇標準綜合體中的蘑菇規范化栽培技術進行箱式種植，分析各品種的產量、質量。

2 結果與分析

2.1 不同培養基質對菌種液氮保藏存活率的影響

不同培養基質對蘑菇菌種液氮保藏存活率的影響，見表1。

結果表明，3種不同培養基存活率存在一定的差異。以PDA為培養基質的菌種，試驗的2個品種以及采用不同的冷凍保護劑均可獲得100%的存活。以小麥為培養基質與10%甘油冷凍保護劑組合，存活率可達98%，以小麥為培養基質與10%二甲亞砜冷凍保護劑組合，存活率只有88%～89%，以小米為培養基質與不同的冷凍保護劑組合，存活率可達94%～98%。

表1 不同培養基的液氮保藏存活率

2.2 保護劑對菌種液氮保藏的存活率影響

保護劑對蘑菇菌種液氮保藏的存活率影響見表2。

表2 冷凍保護劑對菌種液氮保藏存活率影響

結果表明，2種保護劑均以10%濃度可獲得100%的存活率，在5%濃度下的存活率只有97%～98%，2種保護劑之間無明顯的差異。

2.3 凍結速率對菌種液氮保藏成活率的影響

凍結速率對菌種液氮保藏成活率的影響見表3。

2個品種及不同冷凍保護劑，慢速凍結的存活率均為100%，快速凍結的存活率只有76%～84%之間，快速凍結會造成液氮保藏中菌種的大量死亡。

2.4 菌種解凍方式對液氮菌種保藏存活率的影響

菌種解凍方式對液氮菌種保藏存活率的影響見表4。2個品種的快速解凍方式，其菌種存活率均為100%，而慢速解凍方式的菌種存活率只有60%～63%，慢速解凍造成了液氮保藏中的菌種在恢復生長時大量死亡。

表3 凍結速度對液氮菌種保藏成活率的影響

表4 解凍快慢對液氮菌種保藏存活率的影響

2.5 液氮保藏菌種對栽培的產量、質量影響

液氮保藏菌種對栽培的產量、質量影響見表5。

表5 液氮保藏菌種對菌株產量、質量的影響

液氮保藏菌種和常規保藏菌種的產量、質量間均無明顯差異，2個供試的不同品種表現完全一致。

3 討論

液氮菌種保藏的關鍵因素之一是選擇合適的冷凍保護劑，液氮保藏中使用保護劑是防止菌絲中的水成為冰晶，減少細胞膜受損，其一般分為2種類型：一類是進入細胞內，如甘油、二甲亞砜；另一類是細胞外的，大部分是大分子的物質，如聚乙烯吡咯酮、淀粉、蛋白質等。在真菌保藏中主要是使用進入細胞內的冷凍保護劑，如甘油、二甲亞砜。在本文的液氮保藏的對比試驗中，2種保護劑效果沒有明顯的差異。由于二甲亞砜具有強烈的揮發性氣體特性，操作過程中會造成空氣污染及人體傷害，因此甘油更適合作為雙孢蘑菇液氮保藏中的冷凍劑。

真菌的液氮保藏的凍結速度直接影響菌株的存活率。凍結方法主要分為2種，即快速凍結和慢速凍結。快速凍結即把菌種直接從室溫進入液氮中，這樣溫度變化大約有200℃·min－1～300℃·min－1， 而慢速凍結是先控制降溫速度，以 1℃·min－1～2℃·min－1的降溫速度進行降溫， 從室溫降至－40℃左右，然后再進入液氮罐中。大部分真菌的液氮保藏菌種試驗均顯示出慢凍結可獲得較高的存活率[4，5]，與本文實驗結果相符，這主要是由于降溫速度過快，細胞內形成較大的冰晶而使細胞膜受損，增加菌種的死亡率。目前液氮保藏菌種均采用慢速凍結的方法進行冷凍操作。

在液氮保藏菌種的解凍過程中，細胞內的冰晶會對細胞造成傷害，從而引起菌種的死亡，為了提高菌種的存活率，采用快速解凍方式，使細胞內的冰晶快速溶解，減少冰晶對細胞膜損害的時間，并且能夠使細胞內外滲透壓迅速達到平衡，本文采取快速解凍的方法，菌種存活率達到100%，取得良好的效果。

液氮保藏菌種可以完整保存該菌株的栽培特性，液氮保種方式正逐步取代常規的冰箱冷藏，特別是隨著雜交菌株的不斷應用，由于雜種本身所特有的不穩定因素，應用常規保種易造成菌種的退化，經過多年努力的成果很快便因菌株的退化而不能繼續使用。液氮保藏菌種從根本上解決了蘑菇雜交菌種保藏的難題，使優良的雜交菌株能夠長期發揮作用。

[1]Hwang SW.Stability of spawn stocks of the cultivated mushroom after 26 months liquid nitrogen refrigeration[J].Mushroom Sci,1972(8):35－38.

[2]San Antonio JP.Stability of spawn stocks of the cultivated mushroom stored for nine years in liquid nitrogen (－160 to－196 C)[J].Mushroom Sci.,1978(10):103－133.

[3]Jodona MH,Roysea DJ,Jong SC.Productivity of Agaricus brunnescens stock cultures following 5－,7－,and 10－year storage periods in liquid nitrogen[J].Cryobiology,1982(19):602－606.

[4]Challen MP,Elliott TJ.Polypropylene straw ampoules for the storage of microorganisms in liquid nitrogen[J].Journal of Microbiological Methods,1986(5):11－23.

[5]陳燕妍.超低溫凍結保藏擔子菌[J].真菌學報，1987，6(2)：110－117.

[6]Suman BC,Jandaik CL.Preservation of culture of Agaricus bisporus(Lange)Sing.in liquid nitrogen and its effect on yield and characters of fruiting bodies[J].Indian Journal of Mycology and Plant Pathology,1991,21(1):34－37.

[7]Sobieralski K,Salwin M.Effect of spawn storage at the temperature of liquid nitrogen of four strains of field mushroom Agaricus bisporus(Lange)Imbach on its growth and pinhead setting[J].Roczniki Akademii Rolniczejw Poznaniu,2006,40(379):43－51.