大馬勃菌種液體發酵培養條件的研究*

張 帆，王淑敏

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

大馬勃Calvatia gigantean(Batsch ex Pers)Lloyd為中藥馬勃的來源之一，具有止血、解毒、清肺、消腫、利喉等功效，可治療咳嗽、咽喉腫痛、扁桃體炎、外傷出血。由于野生資源不足，為擴大藥源，本實驗擬通過對大馬勃搖瓶發酵培養基進行初步研究，為液體深層發酵工藝研究以及規范化、工廠化生產提供理論依據[1]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

大馬勃Calvatia gigantean(Batsch ex Pers)Lloyd斜面菌種，由長春中醫藥大學藥用真菌研究所提供。

1.2 藥品和試劑

葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸銨、硝酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、磷酸二氫鈉、維生素VB1、3,5-二硝基水楊酸試劑 （DNS）、鹽酸、氫氧化鈉，以上均為分析純，麥麩、豆餅粉、玉米粉。

1.3 試驗儀器

HYG-III迴轉式恒溫調速搖瓶柜 （上海新星自動化控制設備成套廠）；721紫外可見分光光度計 （上海第三分析儀器廠）；101-1A型數顯電熱鼓風干燥箱 （上海滬南科學儀器聯營廠）；超凈工作臺 （蘇州凈化設備廠）；YXQGO-280手提式高壓蒸汽消毒器 （丹東市日用五金廠）。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種培養及指標測定

斜面菌種活化后，在無菌條件下，接入250 mL三角瓶 （培養基裝量100 mL）中，接種量為10%，在搖瓶機中培養，培養溫度為25℃，轉速為150 r·min-1，搖瓶培養16 d，取出，過濾，將菌球烘干并稱其重量，發酵液則通過3,5-二硝基水楊酸法測定其中多糖的含量。

1.4.2 碳源選擇試驗

以馬鈴薯汁20%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO40.10% （pH自然）作為基礎培養基，碳源分別為空白、葡萄糖3%、蔗糖3%、玉米粉汁5%、乳糖3%、麥芽糖3%。每種培養基平行做3次，進行指標測定。

1.4.3 氮源選擇試驗

以馬鈴薯汁 20%、蔗糖3%、KH2PO40.15%、MgSO40.10% （pH自然）作為基礎培養基，氮源分別為空白、蛋白胨2%、酵母膏0.5%、豆餅粉汁5%、黃豆粉汁3%、硝酸銨0.2%、麥麩汁5%、硫酸銨0.2%、牛糞汁5%，每種培養基平行做3次，進行指標測定。

1.4.4 微量元素選擇試驗

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏0.5% （pH自然）作為基礎培養基，微量元素分別為空白；KH2PO40.15%；MgSO40.10%； KH2PO40.15%、 MgSO40.10%； CaO 0.1%、KH2PO40.15% 、 VB10.02% ； NaH2SO40.15% 、 KH2PO40.15%、 VB10.02%； VB10.02%。 每種培養基平行做 3次，進行指標測定。

1.4.5 不同營養元素正交試驗

正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平表

以馬鈴薯20% （pH自然）為基礎培養基，根據上述試驗選擇的最佳碳源、氮源、微量元素進行設計，采用L9(34)正交試驗，對結果進行統計分析確定碳氮源及微量元素的最佳濃度組合。

1.4.6 發酵初始pH選擇試驗

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作為基礎培養基， 將初始 pH 值調至 4、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、8.5、9.0。每種培養基平行做3個，進行指標測定。

1.4.7 不同培養溫度選擇試驗

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作為基礎培養基， 將液體培養基分別置于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃下培養。每種培養基平行做3個，進行指標測定。

1.4.8 不同接種量選擇試驗

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作為基礎培養基， 搖瓶接種量分別按3%、6%、10%、15%、20%比例接種于液體培養基中培養。每種培養基平行做3個，進行指標測定。

1.4.9 不同搖瓶裝量選擇試驗

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作為基礎培養基， 在250 mL三角瓶中分別裝入60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL液體培養基中培養。每種培養基平行做3個，進行指標測定[2－4]。

2 試驗結果與分析

2.1 不同碳源對菌絲生長的影響

不同碳源對大馬勃菌絲生長的影響指標中，菌絲干重（g·100－1·mL－1）分別為 0.2016、 0.2634、 0.6497、 0.5473、0.2243、 0.2467； 多 糖 含 量 （ mg·mL－1）分 別 為 7.454、14.3651、 16.5481、 14.5628、 14.248、 14.2842。 結果表明，在供試5種碳源中，大馬勃菌絲能夠利用葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖，其菌絲長勢和初級代謝產物多糖的含量以蔗糖為碳源時最佳；以葡萄糖、玉米粉、麥芽糖為碳源時較好；以乳糖為碳源時較差，菌絲長勢較弱，多糖含量也較低。從菌絲長勢和初級代謝產物多糖的含量來看，不同碳源順序為蔗糖＞玉米汁＞葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖，因此蔗糖為最佳碳源。

2.2 不同氮源對菌絲生長的影響

不同氮源對大馬勃菌絲生長的影響指標中，菌絲干重（g·100－1·mL－1）分別為 0.5010、 0.6147、 0.6356、 0.5637、0.4829、 0.4743、 0.5832、 0.5013、 0.5459； 多糖含量 （mg·mL－1）分 別 為 14.4655、 15.053、 15.9805、 14.2482、 13.4249、11.858、 14.8007、 14.114、 12.8506。 結果表明， 在供試 8種氮源中，大馬勃菌絲能夠利用蛋白胨、酵母膏、豆餅粉、黃豆粉、麥麩汁、硝酸銨、硫酸銨、牛糞汁。在酵母膏為氮源的培養基中，菌絲長勢最佳，多糖含量最高；當氮源是蛋白胨和麥麩汁時，菌絲長勢較好，多糖含量接近；當氮源為其他時，菌絲生長較緩慢，多糖代謝也較少。不同氮源順序為酵母膏＞蛋白胨＞麥麩汁＞豆餅粉＞牛糞汁＞黃豆粉＞硫酸銨＞硝酸銨，酵母膏為大馬勃菌株的最佳氮源。

2.3 不同微量元素對菌絲生長的影響

不同微量元素對大馬勃菌絲生長的影響指標中，菌絲干 重 （g·100－1·mL－1）分 別 為 0.4006、 0.4647、 0.4372、0.5734、 0.4145、 0.4562、 0.5441； 多糖含量 （mg·mL－1）分別 為 10.1642、 13.062、 11.804、 14.5275、 10.4514、13.439、14.2018。結果表明，在供試6種微量元素中，大馬勃菌絲能夠利用各種微量元素生長。在KH2PO4、MgSO4為微量元素的培養基中，菌絲長勢最佳，多糖含量也最高；當微量元素是VB1和 NaH2PO4、KH2PO4、VB1時，菌絲長勢較好，多糖含量接近；當微量元素為其他時，菌絲生長較緩慢，多糖代謝也較少。不同微量元素培養基的順序 為 KH2PO4、 MgSO4＞VB1＞ NaH2PO4、 KH2PO4、 VB1＞KH2PO4＞ MgSO4＞ CaO、 KH2PO4、 VB1。 KH2PO4、 MgSO4為大馬勃菌株的最佳微量元素。

2.4 正交試驗結果

根據上述試驗結果碳源選擇蔗糖，氮源選擇酵母膏，微量元素選擇KH2PO4、MgSO4，進行正交試驗考察，試驗結果見表2。

通過方差分析表可知，各因素沒有顯著性差異，改用直觀分析，結果可得最佳培養基組合為蔗糖3%、酵母膏0.75%、 KH2PO40.15%、 MgSO40.1%。

2.5 不同pH試驗結果

不同初始pH對大馬勃菌絲生長的影響指標中，菌絲干 重 （g·100－1·mL－1）分 別 為 0.4210、 0.4778、 0.5024、0.5913、 0.5721、 0.5046、 0.5127、 0.4130、 0.3837； 多糖含量 （ mg·mL－1）分 別 為 15.027、 15.3310、 15.1031、16.2793、 15.8917、 15.0239、 15.5714、 14.9335、 14.4096。結果表明，當pH值小于5.0或大于9時，大馬勃菌絲不能生長；當pH值為6.5時，菌絲生物量達到最大值。當發酵初始pH值超過6.5時，隨著pH值的升高，菌絲生物量逐步降低。因此發酵初始pH值6.5為大馬勃液體發酵最適pH值。

表2 不同營養元素的正交試驗結果

2.6 不同培養溫度試驗結果

不同培養溫度對大馬勃菌絲生長的影響指標中，菌絲干 重 （g·100－1·mL－1）分 別 為 0.3004、 0.4367、 0.4750、0.5299、 0.4349； 多 糖 含 量 （mg·mL－1）分 別 為 10.2762、10.3095、 12.1147、 14.596、 12.7008。 結果表明 ， 隨著培養溫度的不斷升高，菌絲生物量不斷增加，當溫度達到28℃時，菌絲生物量和代謝指標多糖含量達到最大，但當培養溫度繼續增高時，菌絲生物量不再增加，反而降低?？梢娕囵B溫度為28℃為大馬勃液體發酵最佳培養溫度。

2.7 不同接種量試驗結果

不同接種量對大馬勃菌絲生長的影響指標中菌絲干重（g·100－1·mL－1）分 別 為 0.237、 0.3064、 0.4796、 0.4249、0.443； 多 糖 含 量 （ mg·mL－1）分 別 為 8.459、 9.3712、12.0073、 11.809、 11.9136。 結果表明， 從菌絲生長發育速度、菌球干重及代謝指標多糖含量進行比較，接種量3%～6%菌絲生長發育速度慢、菌絲干重低、多糖含量少；接種量15%～20%與10%各項指標基本一致，未見明顯差異，考慮接種量過大，浪費菌種，提高成本。因此以10%左右為宜。

2.8 不同搖瓶裝量試驗結果

不同搖瓶裝量對大馬勃菌絲生長的影響指標中菌絲干重 （ g·100－1·mL－1）分 別 為 0.2017、 0.3196、 0.3980、0.3714、 0.2914； 多 糖 含 量 （mg·mL－1）分 別 為 9.325、10.2071、 12.389、 12.906、 12.7834。 當搖瓶中培養基裝量過少時，雖然溶氧量高，但搖瓶內菌絲生長所需的營養供給量不足，影響菌絲生長而導致菌絲生物量??；當搖瓶中培養基裝液量大于100 mL時，由于溶氧量少，同樣不利于菌絲生長，影響菌絲生物量。因此，250 mL三角瓶中裝液量在100 mL左右較為合適，菌絲生物量最高。

3 討論

本試驗通過對大馬勃液體發酵培養條件進行初步篩選，確定最佳液體培養基為馬鈴薯20%、蔗糖3%、酵母膏 0.75%、 KH2PO40.15%、 MgSO40.1% （pH 自然）； 培養條件為pH值6.5，溫度28℃，接種量10%，搖瓶裝量250 mL錐形三角形100 mL。為液體深層發酵工藝研究以及規范化、工廠化生產提供了理論依據。

[1]鄭漢臣，蔡少青.藥用植物學與生藥學 [M].北京：人民衛生出版社， 2005(11)： 385－388.

[2]蔡丹鳳，陳美元，郭仲杰，等.茯苓菌株生物學特性的研究[J].中國食用菌， 2009， 28(1)： 23－26.

[3]王濤，田文，游玲，等.大禿馬勃深層培養條件初探[J].食用菌，2009(2)： 13－14.

[4]楊小方，薛璟，徐廣忠，等.馬勃液體培養條件的研究[J].包裝與食品機械， 2009， 27(5)： 106－110.