Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1在結直腸癌中的表達及臨床意義

陳中皓 王學志 徐銘 楊華 黃忠華

上海市長寧區中心醫院胃腸外科，*病理科，▲化驗科，上海 200336

結直腸癌是人類常見惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤死亡原因的第二位，近年來發病率呈明顯上升趨勢［1］。侵襲轉移是惡性腫瘤最重要，也是最本質的生物學特征，臨床上主要采用以手術為主的綜合治療，但效果并不理想，其主要原因是腫瘤局部的復發和轉移。近年來的研究表明，多種生物學指標與結直腸癌發生、發展以及手術后的復發轉移和預后有關。我們采用免疫組化方法檢測Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1基因在結直腸癌組織中的表達，并探討其與結直腸癌臨床病理因素的關系及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2002年6月—2004年1月我院手術切除的原發性結直腸癌患者標本72例，所有患者術前均未接受放療、化療及其他針對腫瘤的特殊治療。有結直腸癌家族史者不納入本研究。其中，男性45例，女性27例；年齡33～85歲，中位年齡54歲。根據2009年國際抗癌聯盟第七版惡性腫瘤TNM分期進行臨床分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期19例，Ⅲ期30例，Ⅳ期11例。病理分級：高、中、低分化分別為18例、30例、24例。取所有腫瘤切除標本切端非癌組織(距癌＞5 cm)作為正常對照。復發轉移病例經病理、CT、B超、X光檢查4項中至少1項證實。

1.2 隨訪

術后第1年每3個月隨訪1次，以后每6個月隨訪1次，隨訪截止時間為2009年2月， 中位隨訪時間52個月(8～78個月)。本組共5例失訪，隨訪率為93.1%。

1.3 免疫組化方法

鼠抗人Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1單克隆抗體和SP試劑盒由美國Santa Cruz公司生產，將入選病例的原發灶病理蠟塊進行常規切片，制成4 μm厚的切片，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復，SP免疫組化染色。染色步驟嚴格按照說明書進行，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判斷

細胞膜和(或)細胞質出現棕黃色細顆粒為陽性細胞，判斷采用半定量積分法［2-3］，記數5個高倍視野，將平均陽性細胞率分為5類：0分＜5%；1分5%～＜25%；2分25%～＜50%；3分50%～＜75%；4分≥75%。根據陽性染色強度分為4類：無著色0分；淡黃色1分；黃色2分；棕黃色3分；兩者積分相加，按積分高低分為：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。包括弱陽性、陽性、強陽性均定義為陽性。

1.5 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，采用χ2檢驗對數據進行統計，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 術后復發轉移情況

全組總的術后復發轉移率為27.8%(20/72)，局部復發率為8.3%(6/72)，遠處轉移率為19.4%(14/72)。術后復發轉移的中位時間為12個月(6～46個月)，術后復發轉移在2年內出現者占70.0%(14/20)，在3年內出現者占85.0%(17/20)。

2.2 Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1在結直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達

該5個分子陽性染色主要定位于細胞質中(圖1)。在結直腸癌中表達的陽性率分別為62.5%(45/72)、66.7%(48/72)、55.5%(40/72)、61.1%(44/72)、79.2%(57/72)。結直腸癌組織與對照非癌組織中表達差異均有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1在結直腸癌組織中的表達與臨床病理特征及預后的關系

Survivin表達與浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、術后復發轉移有關；MMP-2表達與淋巴結轉移、TNM分期、術后復發轉移有關；nm23-H1表達與淋巴結轉移、TNM分期相關；VEGF表達與浸潤深度、TNM分期、術后復發轉移有關；而受體Flt-1表達與臨床病理及預后因素均無關。

3 討 論

Survivin屬凋亡家族(IAP)的成員，又稱生存素，全長15 kb，位于染色體17q75。通常Survivin僅在胚胎和胸腺中有微弱表達，但Survivin在幾乎所有的人類癌組織中都有表達［4］。Survivin可能主要通過2條途徑來抑制細胞凋亡：⑴直接抑制凋亡終末效應酶Caspase-3和Caspase-7的活性來阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程; ⑵Survivin與周期蛋白激酶CDK4、CDK2相互作用阻斷凋亡信號轉導通路［5］。Kawasaki等［2］報道，Survivin在結直腸癌的表達陽性率為53.2%，而癌旁正常組織則無Survivin表達。本組研究顯示，Survivin在結直腸癌組織中的表達陽性率為63.0%，與對照非癌組織中表達陽性率(12.5%)相比，差異有統計學意義。并且Survivin在結直腸癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度(P＜0.01)、淋巴結轉移(P＜0.01)及TNM分期(P＜0.05)相關，說明Survivin在結直腸癌的發生、發展及轉移中起著重要作用。另外，本組研究顯示，Survivin在結直腸癌組織中的表達與腫瘤復發轉移(P＜0.05)呈正相關，提示Survivin陽性表達可能提示預后不良。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是降解細胞外基質的主要家族之一。它們在腫瘤浸潤轉移中扮演著重要角色，MMPs通過降解細胞外基質中的大分子物質(如膠原、層黏連蛋白等)而破壞癌細胞浸潤的物理屏障。MMP-2是MMPs家族中分布最廣的成員，因其主要反應底物為細胞外基質中的Ⅳ型膠原故又稱之為Ⅳ型膠原酶［6］。當細胞惡變時常有MMP-2的升高，在多種惡性腫瘤細胞中均發現MMP-2表達的增高，在部分腫瘤中還發現隨著腫瘤惡性程度的增高，MMP-2的表達也增高，且與腫瘤的浸潤和轉移相關［7-8］。本研究中，MMP-2在結直腸癌中的表達與年齡、性別、分化程度和浸潤深度均無相關性，與淋巴結轉移、TNM分期、復發轉移相關(P＜0.01)。可見，MMP-2在結直腸癌的侵襲轉移中起著重要作用，并且是惡性侵襲性腫瘤的一個敏感指標。

nm23-H1基因是1988年Steeg等［9］從鼠K-1735黑色素瘤的具有不同轉移潛力的細胞系中分離出來的。nm23-H1基因定位于17q21.3，該基因全長約10 kb， 編碼一種相對分子質量約為17×103的蛋白質，具有二磷酸核苷激酶(NDPK)活性，NDPK的生物學功能是參與體內三磷酸核生成，通過影響微管聚合狀態及G蛋白介導信號傳導通路，而調節細胞代謝，從而對腫瘤增殖、分化、侵襲及轉移起重要作用［9-12］。Leone等［13］首先報道約22%結腸癌中有nm23等位基因缺失。Berney等［14］研究認為nm23-H1既具有結直腸腫瘤轉移抑制功能，并與腫瘤浸潤發展呈負相關。本研究結果與之基本一致，nm23-H1表達與淋巴結轉移及腫瘤TNM分期呈負相關，而與患者年齡、性別、腫瘤分化、浸潤深度等無關。由此可見，nm23-H1基因突變或表達異常是結直腸癌發展中的重要事件，可作為提示腫瘤淋巴結轉移的1項指標。

VEGF是最重要的血管生成因子之一，又稱血管通透因子。VEGF基因位于6p21.3，全長14 kb，由8個外顯子，7個內含子組成［15］。VEGF具有促血管形成，增加血管通透性的雙重功能，在創傷愈合、胚胎期血管形成及腫瘤的發展和轉移等方面均起著重要作用，對腫瘤血管基質形成及腫瘤生物學行為均有重要影響，可作為腫瘤代謝及轉移的標志。本研究結果顯示：VEGF表達在結直腸癌組織明顯高于對照正常組織，并且與腫瘤浸潤深度、TNM分期、腫瘤復發轉移相關，提示VEGF在結直腸癌發生、發展中起重要作用，并可作為結直腸癌預后判斷的指標。

Flt-1是血管內皮生長因子受體家族中的成員之一，他主要在血管內皮細胞內表達，通常情況下Flt-1呈低表達，僅用于維持正常的微血管密度、基本滲透功能，以利于營養物質代謝。Flt-1激活后具有調節內皮細胞之間以及內皮細胞與基底膜之間的相互作用，能促進血管腔的形成。本研究顯示Flt-1在結直腸癌組織中的表達率明顯高于對照組，卻與年齡、性別、分化程度、浸潤深度、TNM分期及預后均無相關性。

總之，結直腸癌的發生、發展是個復雜的多基因參與的多步驟過程，Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1在結直腸癌的發生中起著重要的作用，可能與腫瘤惡性轉化及進展轉移過程有關。聯合檢測多個相關分子在結直腸癌中的表達將有助于判斷腫瘤的生物學特征和預后，并為進一步基因診斷及分子靶向治療提供分子依據。

［1］Weir HK, Thun MJ, Hankey BF, et al.Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2000, featuring the uses of surveillance data for cancer prevention and control ［J］.J Natl Cancer Inst, 2003, 95(17):1276-1299.

［2］Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD, et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer［J］.Cancer Res, 1998, 58(22):5071-5074.

［3］Volm M, Koom?gi R, Mattern J.Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer ［J］.Int J Cancer, 1997, 74(1):64-68.

［4］Ambrosini G, Adida C, Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma ［J］.Nat Med, 1997, 3(8):917-921.

［5］Ambrosini G, Adida C, Sirugo G, et al.Induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation by survivin gene targeting［J］.J Biol Chem, 1998, 273(18):11177-111782.

［6］Vihinen P, K?h?ri VM.Matrix metalloproteinases in cancer:prognostic markers and therapeutic targets ［J］.Int J Cancer, 2002, 99(2): 157-166.

［7］Kraiem Z, Korem S.Matrix metalloproteinases and the thyroid［J］.Thyroid, 2000, 10(12):1061-1069.

［8］Sun J, Hemler ME.Regulation of MMP-1 and MMP-2 production through CD147/extracellular matrix metalloproteinase inducer interactions ［J］.Cancer Res,2001, 61(5):2276-2281.

［9］Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential［J］.J Natl Cancer Inst, 1988, 80(3):200-204.

［10］Steeg PS, Cohn KH, Leone A.Tumor metastasis and nm23:current concepts［J］.Cancer Cells, 1991, 3(7):257-262.

［11］Lee CS, Gad J.nm23-H1 protein immunoreactivity in intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix ［J］.Pathol Int, 1998, 48(10):806-811.

［12］MacDonald NJ, De la Rosa A, Benedict MA, et al.A serine phosphorylation of Nm23, and not its nucleoside diphosphate kinase activity, correlates with suppression of tumor metastatic potential［J］.J Biol Chem, 1993, 268(34):25780-25789.

［13］Leone A, McBride OW, Weston A, et al.Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer ［J］.Cancer Res, 1991,51(9):2490-2493.

［14］Berney CR, Fisher RJ, Yang J, et al.Protein markers in colorectal cancer: predictors of liver metastasis［J］.Ann Surg, 1999, 230(2):179-184.

［15］Risau W.Angiogenic growth factors ［J］.Prog Growth Factor Res, 1990, 2(1):71-79.

［16］Shibuya M.Vascular endothelial growth factor receptor-1(VEGFR-1/Flt-1): a dual regulator for angiogenesis ［J］.Angiogenesis, 2006, 9(4):225-230.