復雜性疾病遺傳研究中Tag SNP的篩選及其潛在功能預測

朱益民，許玉洋，凌 潔

(浙江大學公共衛生學院流行病學與衛生統計學系，浙江 杭州 310058)

單核苷酸多態性(singlenucleotide polymorphism，SNP)指人類在基因組水平上存在單個核苷酸變異而產生的DNA序列多態性。SNP是人類最常見的可遺傳變異形式，占人類基因組遺傳多態性的90%以上。SNP作為第三代遺傳標記，廣泛存在于人類基因組中，平均每300～600個堿基對中就有1個SNP，由此可見人類基因組中存在500～1000 千萬個SNP。然而，約有95%SNP位于非編碼區，稱為非編碼SNP(non-coding SNP)，其中位于基因調控區的SNP位點稱為調控 SNP(regulation SNP)。存在于基因編碼區的SNP位點稱為編碼SNP(coding SNP)。在編碼SNP中，若堿基變異不改變所編碼的氨基酸，稱為同義 SNP(sense SNP);否則，稱為錯義 SNP(mis-sense SNP)。另外，有部分堿基變異，導致終止密碼子出現，稱為無義SNP(non-sense SNP)。能引起基因氨基酸序列、轉錄與翻譯調控、剪接等改變的SNP可能與疾病發生有關。在人類基因組中，只有部分SNP具有生物學功能，因此，篩選與疾病相關的SNP標志成為分子遺傳學和分子流行病學的重要任務。在全基因組測序技術還不能普及的條件下，限于現有技術、人力、物力、財力，目前尚不能對所有SNP進行研究。即便采用SNP芯片也只能檢測百萬左右位點。因此，如何選擇候選SNP成為分子遺傳學關聯分析的關鍵。

在基因組中，SNP不是隨機分布的。某些SNP位點的等位基因同時出現在一個單體型中的次數多于自由分離重組的期望值，即存在連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)。LD區可推測其余SNP在基因組中的分型信息的SNP，稱為Tag SNP。選擇Tag SNP可減少SNP分型數量。通過生物信息學軟件可以預測Tag SNP的潛在生物學功能，具有非同義突變、轉錄調節和剪接功能等潛在生物學功能的SNP應成為優先選擇的位點。我們利用SNP相關數據庫和潛在功能軟件，以IGFBP 7為例介紹候選Tag SNP的篩選方法，以供研究者參考。

1 單核苷酸多態公共數據庫

1.1 單核苷酸多態性數據庫(dbSNP)dbSNP是由美國國家生物技術信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)與美國國立人類基因組研究所(National Human Genome Research Institute)在1998年9月合作構建的［1］。數據主要來源有:由人類基因組計劃預測得到的SNP，約占65%;私人或研究機構研究者提交的實驗結果，約占28%。dbSNP收錄了與疾病相關的突變和中性突變，主要是單核苷酸替換、短的缺失和插入多態;現已擴展收錄了微衛星重復和插入缺失多態。每條記錄都包括突變類型、突變點附近DNA序列信息、檢測該突變點的實驗條件、出現該突變的群體特征描述及群體基因分型頻率。dbSNP提供在線人類孟德爾遺傳數據庫OMIM的鏈接，可查詢由遺傳變異引發的疾病或疾病的致病遺傳變異。dbSNP可廣泛用于研究生物學問題，包括物理定位、功能分析、藥物基因組學、關聯研究及進化研究等。

1.2 人類基因組單體型圖(haplotype map，HapMap)計劃 HapMap由美國、英國、加拿大、日本、中國和尼日利亞的科學家合作完成，目標是構建人類DNA序列中多態位點的常見模式，運用單體型分型方法找出約50萬個Tag SNP來代替整個人類基因圖譜中的SNP集合，使選出的Tag SNP與表型間的關聯更明顯。HapMap收錄了與疾病相關基因的重要信息，包括:基因型、等位基因頻率、LD等。研究者可通過染色體位置、基因名稱、SNP位點等進行相應信息的查詢;可根據研究目的和需要進行相應的配置設置，如:人群、r2、MAF等。HapMap已成為人們研究與人類疾病、藥物和環境等相關基因的重要工具。

1.3 SNP 研究聯盟(The SNP Consortium，TSC)提供的數據庫 TSC是SNP國際聯合會的官方數據庫，收集了近18萬個SNP數據［2］。目標是在全基因組范圍內尋找30萬個SNP，并將與SNP相關的信息公之于眾，由之發現的SNP數據也同時向dbSNP提交。TSC自1999年成立以來，SNP數據量不斷增加，且提供強大的查詢服務:包括SNP在等位基因中出現的頻率、基因型、SNP定位和連鎖圖譜、SNP檢測和驗證的實驗指導等。其數據主要由斯坦福大學、華盛頓大學、Sanger中心及Whitehead研究所這4所測序中心提供支持和更新，由美國冷泉港實驗室負責維護。

1.4 人類基因組突變數據庫(The Human Genome Variation，HGVbase)HGVbase由歐洲生物信息研究所EBI、歐洲分子生物學實驗室EMBL及瑞典卡羅林研究所聯合構建，主要收錄了DNA多態和短小的插入、缺失突變。數據來源于文獻、其他數據庫和上述實驗室工作結果的提交。該數據庫對基因名稱和SNP分別確定了9位數的ID號碼。每條記錄包括SNP上下游各25個核苷酸序列，人群中的等位頻率、編碼區、啟動子和剪接位點，還有GenBank及其他數據庫的鏈接。HGVBase具有易理解和高準確率的特點，有利于研究者用實驗或生物信息學方法來分析基因組突變的結果［3］。

另外，美國國立衛生院NIH提供的與癌癥和腫瘤相關候選 SNP數據庫(http://ipg.nci.nih.gov/)、人類基因突變數據庫 HGMD(http://www.hgmd.cf.no.uk/)、華盛頓大學按染色體位置組織的SNP數據庫(http://ibc.wustl.edu/snp)、美國懷特和特研究所建立的人類 SNP 數據庫(http://www.genome.wi.nit.edu/SNP/humHn/index.html)、瑞典卡爾林斯卡研究院建立的數據庫(http://hgbHse.cgr.ki.se)等都可用于SNP的選擇。

2 SNP位點功能分析工具

現有許多軟件可預測SNP變異引起的功能改變，如同義突變、無義突變、啟動子、增強子等轉錄翻譯的調節、剪接位點等。常用的軟件有FastSNP、SNP Function Prediction、F-SNP、HSLS、SNPeffec、SNPinfo、SNPselector、PolyDoms等。

2.1 FastSNP(http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/pages/input_CandidateGeneSearch.jsp)這是一個對SNP潛在功能進行預測的在線軟件［4］。根據dbSNP、 Ensembl、 TFSearch、PolyPhen、ESEfinder、RescueESE、Genebank 和Swiss-Prot數據庫分析的結果，采用決策樹(decision tree)方法對12種SNP引起的功能改變進行定量評價和危險度分級。SNP功能類型及相應的分級評分見表1。根據危險度評分的結果(0-5)估計危險程度高低，供用戶選擇候選SNP位點。危險度分級評價過程如圖1所示。FastSNP用UCSC Golden Path和NCBI Blast對候選SNP進行質量控制。它基于單體型數據庫HapMap，既獲取SNP的單體型及LD信息，也可進一步減少用于分型的候選基因的數量。

表1 FastSNP軟件預測SNPs潛在功能效應及其預測風險值Table 1 Potential functional effects and risk value predicated by FastSNP

圖1 基于SNP位點的功能效應進行SNP選擇的決策樹Fig.1 Decision tree for selecting SNP loci based on the function effects of SNPs

2.2 SNP Function Prediction(http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm) 該軟件旨在綜合利用計算、實驗、流行病學資料及GWAS的結果和LD的信息，進一步研究遺傳圖譜，篩選SNP位點。用戶可通過提供一個或一系列的基因名、基因ID、SNP rsID或者染色體位置等多條途徑進行相應信息的查詢。該軟件主要功能:①基于LD、GWAS結果和SNP功能預測信息篩選Tag SNP;②結合GWAS和LD信息篩選功能性SNP;③LD或基因結構視圖;④預測SNP功能，查詢MAF;⑤DNA序列上SNP信息視圖等。其中SNP潛在功能效應有:①轉錄因子結合位點SNPs;②外顯子剪接增強子(ESE)、外顯子剪接沉默子(ESS)SNPs;③miRNA(miRanda)、miRNA(Sanger)SNPs;④nsSNP;⑤終止密碼子SNPs;⑥RegPotential(RP):編碼區 SNPs的 RP Score相對高，所以常用于編碼區SNP的篩選。RP Score來源于UCSC基因生物信息網(http://genome.ucsc.edu/);⑦ Conservation:編 碼 區SNPs的conservation score相對更高，所以常用于編碼區的SNP的篩選，其數據也來源于UCSC基因生物信息網。SNP Function Prediction提供了在11個人群當中的等位基因的頻率。

2.3 F-SNP(The Functional Single Nucleotide Polymorphism) 該軟件提供了16個與SNP相關的生物信息學工具和數據庫的綜合信息(http://compbio.cs.queensu.ca/F － SNP)，其功能效應主要指剪接、轉錄、翻譯及翻譯后水平，有助于識別那些對人類健康有潛在功能效應的SNPs［5］。其中識別非同義SNP的工具有PolyPhen、SNPeffect、SIFT、SNPs3D 和 LS-SNP;識別外顯子剪切區 SNP的有 ESEfinder、RescueESE、ESRSearch和PESX;識別無義突變SNP和內含子剪切位點SNP的有Ensembl;在啟動子區識別轉錄調控SNP的有TFSearch和Consite;識別在其他轉錄調控區(如microRNA，CPG島)SNP的有Ensembl和GoldenPath;識別翻譯后修飾位點SNP的有KinasePhos、OGPET和 Sulfinator［6］。

F-SNP對SNP功能評估程序見圖2。對每種類型采用一系列的測試以確定該SNP有無功能效應。首先，利用dbSNP和Ensembl確定基因區域(編碼區或內含子區等)。確定后繼續執行其他測試。Ensembl用于檢測無義突變，若SNP是錯義突變，繼續用5種不同的工具(PolyPhen、SIFT、SNPeffect、SNPs3D 和 LSSNP)進一步測試以檢測有無非同義替換。綜合這些結果，確定SNP是否具有潛在功能效應(在圖中標記為‘Functional’)。

另外，HSLS:SNP Function Portal-a數據庫傾向于查詢蛋白質功能效應［7-11］。SNPeffect數據庫基于 dbSNP，主要用于查詢 nsSNPs［12-14］。SNPinfo、PolyDoms、SNPselector 等軟件［13，15］都可用于SNP潛在功能的預測［16-17］。

圖2 F-SNP中功能評估的決策程序Fig.2 Decision-making process of functional assessment in F-SNP

3 候選SNP篩選應用

3.1 篩選策略 ①基因區域:IGFBP 7基因上游3000 bp到下游3000 bp區域;②人種為CHB、CHD、JPT 或 Asia;③用 FastSNP 和 SNP Predication Function等軟件預測功能改變類型:無義突變、錯義突變、同義突變、剪接調控、轉錄因子結合位點、增強子、microRNA位點;④MAF選擇標準≥0.15，如為錯義突變、無義突變和剪接調控 SNP，MAF 放寬至≥0.05;⑤以 r2≥0.8為標準，選擇TagSNP。

3.2 篩選結果 依據上述策略，綜合各功能分析軟件結果并結合相關的GWAS研究以及相關理論知識，IGFBP 7基因的候選SNP篩選結果如下:轉錄因子結合位點11個，內含子增強子31個，內含子增強子和轉錄因子結合位點4個，剪接位點1個，共47個SNPs。另外，還有一些SNP不知道特定人群中MAF，但可能存在潛在功能效應的SNP，結果如下:剪接調控和轉錄因子結合位點1個，剪接調控1個，同義突變1個，剪接調控和終止密碼子1個，剪接調控、轉錄因子結合位點以及終止密碼子1個，同義突變和剪接調控4個，啟動子調節區域10個，啟動子調節區域和轉錄因子結合位點1個，錯義突變(保守)4個，錯義突變(保守)和剪接調控4個，錯義突變(非保守)和剪接調控2個，總共篩選出30個SNPs。

4 幾個軟件間的比較

4.1 不同軟件的特點

4.1.1 FastSNP 的優點［18-20］①在功能報告中，提供了用戶檢測SNPs序列質量并驗證SNP在人類基因組中位置唯一性的按鈕。②整合了UCSC、NCBI及 Ensembl等數據庫。③采用NCBI Blast將SNP序列延長500 bp，避免了因SNP序列太短而不能設計質量較好的引物。④提供了來源于HapMap的單體型數據。這樣研究者只需在LD的SNPs中選擇最少的SNPs作為標記(如Tag SNPs)來進行關聯研究，大大減少了基因分型的成本。⑤采用一個完整的決策樹對SNP進行風險排序，同時還考慮了一些之前沒有考慮的新功能，如由外顯子的跳躍和蛋白質結構穩定性的變化導致蛋白質結構域的丟失，但FastSNP查詢時間較長。

4.1.2 SNP Function Prediction 既可以篩選TagSNP，又可預測SNP的功能效應，結果以可視化圖表顯示，使研究者能夠對結果進行直觀的分析［6，21-22］。

4.1.3 F-SNP是一個通過計算來收集關于SNPs信息的綜合性資源庫。這些信息來源于4個層次:命名、蛋白質編碼、剪接調控、轉錄調控和翻譯后調控。SNP的功能信息隨著其他預測工具和生物分子實驗定期更新，整合更多人類疾病的數據庫，擴大疾病譜，包括常見病和復雜疾病。F-SNP資源庫查詢到的信息較全面，可通過相應的超鏈接獲取所需信息［23-27］。

4.1.4 PolyDoms現有版本不包含SNP位點同時出現復雜的單倍型等信息，但納入SNP單體型數據，這將方便檢索基因型頻率數據，選擇關聯研究中的Tag SNPs，查看單體型圖形和檢查標記間LD模式。

4.2 不同軟件篩選結果不一致的原因 以FastSNP和SNP Function Prediction 2個軟件為例進行比較。在IGFBP 7的SNPs的篩選過程中發現，前者預測有158個，后者預測有117個，兩者預測一致的有51個(圖3)。結果存在不一致的主要原因可能是:①2個軟件評估方法不同:FastSNP是依據決策樹進行危險度分級，共有12種功能效應類型，風險等級從0到5;SNP Function Prediction共有11種功能效應類型;②FastSNP和SNP Function Prediction這2個軟件的生物信息學數據庫和分析工具的服務器有交叉但又有不同，這有可能導致篩選結果存在交叉，又有所不同。FastSNP提供了8個生物信息學數據庫和分析工具服務器用于預測SNP 的功能效應:dbSNP、Ensembl、TFSearch、PolyPhen、ESEfinder、RescueESE、NCBI的基因庫及 Swiss-Prot，使用 UCSC Golden Path及NCBI Blast對候選SNP進行質量控制，基于單體型數據庫HapMap以獲取SNP的單體型和LD的信息。SNP Function Prediction基于dbSNP、HapMap、dbGaP、NCBI Entrez Gene、Polyphen、SNPs3D、UCSC等得到SNPs的相關信息。其他可能的原因有待進一步探討。

圖3 FastSNP和SNP Function Prediction 2個軟件篩選IGFBP 7的SNPs的結果比較Fig.3 Comparison ofselected SNPsin IGFBP 7 gene between FastSNP and SNP FP

總之，應用各種軟件來選擇功能性SNPs是研究疾病的可遺傳變異的有效方法;當然，必須注意的是SNPs僅僅影響蛋白質穩定性并不是疾病預測的充分條件;目前也沒有1個工具可以涵蓋所有SNPs可能產生的效應，即使是單一的1個生物學功能也還不行，所以在選擇SNPs位點時可以考慮結合多個軟件進行預測，并結合自己的研究目的選擇合適的SNP位點。

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