連錢草高效液相色譜指紋圖譜研究

廖亞玲，安薇，胡光煦

(湖北省中山醫院藥學部，武漢 430033)

連錢草為唇形科植物活血丹［Glechoma longituba(Nakai)Kupr.］的干燥地上部分，具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫等功能。近年來，有關連錢草的深入研究受到不少藥學工作者的青睞，相繼有學者對其所含的三萜酸類［1］、黃酮類［2-4］等化學成分進行了分離提純，并建立了三萜酸類［5-7］(主要為齊墩果酸和熊果酸)及黃酮類［7-10］(主要為總黃酮、芹菜素和木犀草素)成分的定量分析方法，以此來更好地控制該藥材的質量。但中藥提取物是多種活性成分的混合體，其藥效不是來自單一的活性成分，采用任何單一的活性成分或指標都難以準確地評判中藥的真偽和優劣，這種測定單一成分含量的方法并不能全面反映連錢草藥材的內在質量。

筆者在本實驗中采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立了連錢草的色譜指紋圖譜，并對不同產地連錢草的指紋圖譜進行了比較分析，研究連錢草藥材之間差異。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU高效液相色譜儀(包括LC-20AT梯度二元泵，SPD-20A檢測器，日本島津)，金利超聲清洗器(上海杰里科技有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，SHZ-ⅲ型循環水真空泵和RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，101-1AB型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，METTLER TOLEDO 320 pH計(瑞士)。

1.2 試藥 芹菜素對照品(南京青澤科技醫藥科技開發有限公司)，甲醇、乙腈(色譜純，Fisher Scientific)，其余試劑均為分析純，水為超純水。連錢草藥材見表1。除去雜質，自然晾干，粉碎，過內徑0.425 mm(40目)篩，使用前60℃干燥4 h。

表1 連錢草藥材Tab．1 The resources of Herba Glechomae samples

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取芹菜素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，配制成1 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備方法的選擇 采用四因素三水平正交設計，包括乙醇用量、提取時間、提取次數和乙醇體積含量。以色譜主要峰面積(單峰面積＞1%)和各水平極差(R)為評價指標，最終確定的連錢草提取方法為:稱取連錢草藥材2 g，用80%乙醇30 mL超聲提取30 min，共提取4次。

2.1.3 供試品溶液的制備 將連錢草藥材粉碎，過篩孔內徑0.425 mm(40目)篩，60℃干燥4 h。精密稱取2 g，用80%乙醇超聲提取4次，每次30 mL，濾過，合并濾液，置旋轉蒸發儀減壓回收溶劑至干，用80%乙醇轉移至25 mL量瓶中，定容，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過后備用。折合藥材濃度為80 mg·mL-1。

2.2 色譜條件

2.2.1 色譜條件的優化 由于中藥樣品成分復雜，色譜條件較難確定，筆者借助計算機輔助優化軟件DryLab［液相資源公司(LC Resources INC.)的計算機模擬軟件，用于等度和梯度色譜條件預測］進行優化。以湖北恩施產連錢草提取液為優化對象。流動相選用(A)甲醇(0.5%醋酸，V/V)-(B)水(0.5%醋酸，V/V)，初始梯度洗脫程序為:A/B(5/95→95/5，V/V)，tG=45 min，最晚流出峰和最早流出峰的時間差△tR與梯度時間tG之比遠大于0.4，適于梯度洗脫。儀器的系統滯留體積，(VD)約為3 mL。遵照DryLab軟件設計方法，設計優化梯度速率和溫度的條件，流動相梯度范圍為A/B(5/95→95/5)，溫度范圍為30～50℃，如圖1所示。

圖1 兩因素梯度實驗設計圖Fig．1 The chematic diagram of two-factor gradient designs

2.2.2 色譜柱 Hypersil ODS2(4.6 mm×200 mm，5 μm);流動相:甲醇(0.5%醋酸，V/V):水(0.5%醋酸，V/V)，梯度洗脫;流速:1 mL·min-1;柱溫:40℃;檢測波長:0→60 min 330 nm，60→90 min 280 nm;進樣體積:20 μL。梯度洗脫程序見表2。

3 結果

3.1 不同梯度時間和溫度下色譜峰的保留時間和峰面積 見表3。

表2 梯度洗脫程序Tab．2 The gradient elution program

將以上條件下得到的主要峰的保留時間和峰面積，以及滯留體積輸入DryLab中，經過色譜峰校對后，得到梯度速率和溫度的兩因素分辨圖，見圖2。

如圖2所示，梯度時間從50 min延長到90 min，梯度變化速率從1.8%·min-1到1%·min-1(梯度范圍/梯度時間)均可增加分離度;而柱溫從30℃到50℃，分離度也得到改善。40℃以后，分辨率增加不明顯，為延長色譜柱使用壽命，最后確定柱溫為40℃。

表3 不同梯度時間和溫度下色譜峰的保留時間和峰面積Tab．3 Retention time and peak area of peaks for different gradient time and column temperature

圖2 溫度梯度時間兩因素分辨圖Fig．2 Resolution map of temperature and gradient time

在梯度洗脫過程中，除梯度速率對色譜行為有影響外，梯度范圍對于色譜峰在時間軸上的均勻分布及增加柱的峰容量也有顯著影響。由于DryLab以4個基本梯度為基礎已經構建出模型，對梯度的修改可以直接在軟件中進行。最后確定以15 min為分界點，在DryLab中模擬結果如圖3所示。以上述條件實際進樣分析所得色譜圖如圖4(A)所示。實驗過程中，對梯度分界進行了微調，即以12 min為分界點，前段梯度速率為2.8%，后期梯度速率降低至0.75%·min-1，得到圖4(B)，峰形滿足實驗要求。采用分段檢測波長的方法，即前期(0→60 min)采用330 nm為檢測波長，后期(60→90 min)采用280 nm為檢測波長。

3.2 指紋圖譜的建立 連錢草樣品在上述色譜條件下，測得色譜圖可分為兩個區域:30 min之前的譜峰密集區和隨后的譜峰稀疏區。34 min附近均有一個中等強度峰(峰7)，經在線紫外光譜和加入對照品溶液的方法證實為芹菜素，選擇它為參照峰(標記為S)。在此基礎上求出所有色譜峰的相對保留值。

圖3 DryLab梯度程序模擬色譜圖Fig．3 The chromatogram simulated by DryLab

圖4 實際進樣所得色譜圖(檢測波長330 nm)A.按DryLab模擬結果所得色譜圖;B.修改梯度分段點后的色譜圖Fig．4 The chromatogram of Glechoma longituba’s extraction in practiseA.Actual chromatogram according to the elution program simulated by DryLab;B.Actual chromatogram after changing segmenting point

在各產地連錢草的指紋圖譜中，比較10個不同產地連錢草指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間、峰面積、分離情況等，確定了13個共有峰，這些色譜指紋峰為連錢草樣品的100%共有峰，這13個色譜峰為連錢草的基本組成成分，可作為鑒別連錢草樣品的必要條件之一。

不同產地連錢草指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積(共有峰與參照峰峰面積的比值)分別見表4，5。13個共有峰相對保留時間的 RSD＜0.483%，但相對峰面積的 RSD＞57.04%，說明不同產地連錢草所含的共有化學成分的含量差異較大。

3.3 指紋圖譜的相似度評價和聚類分析 中藥色譜指紋圖譜的相似度評價是指紋圖譜用于中藥質量評價和質量控制的重要環節。筆者在本實驗中以10個產地連錢草指紋圖譜中各共有峰的平均數建立標準指紋圖譜，采用夾角余弦作為相似度的評價指標，以相對峰面積為參數，用SPSS軟件計算10個產地連錢草的指紋圖譜和標準指紋圖譜之間的相似度和樣品之間的相似度。結果產自湖北咸寧、湖北十堰、湖北恩施、湖北荊州1、湖北荊州2、湖北武漢、安徽六安、貴州安順、江蘇盱眙和對照藥材的相似度分別為 0.918，0978，0.961，0.933，0.905，0.945，0.970，0.949，0.910，0.942;上述各產地藥材與對照藥材之間的相似度分別為0.916，0.973，0.930，0.948，0.845，0.923，0.960，0.985，0.884。各產地連錢草藥材的相似度均＞0.9，反映了不同產地連錢草藥材的同源性。對各產地與對照藥材之間的相似度分析，除湖北荊州2和江蘇盱眙的相似度分別為0.845和0.884，其他產地均＞0.9。進一步應用SPSS軟件，采用組間關聯法(between-group linkage)，選用夾角余弦為測度，進行聚類分析。10個產地的連錢草藥材可分為3類:湖北恩施、湖北武漢、湖北十堰、湖北荊州1和對照藥材為一類;安徽六安、貴州安順、湖北咸寧和江蘇盱眙為一類;湖北荊州2單為一類。從藥材來源上講，湖北荊州1和湖北荊州2均來自于同一地區，只是采集時間不同，且前者為種植，后者為野生，但兩者在三大分類中各占一類;從其共有峰的相對峰面積來看，峰2、峰8-13的相對峰面積均存在較大差異。其他各產地共有峰的相對峰面積也存在較大差異。這說明連錢草所含化學成分的含量可能與其生長環境、栽培方式、采收時間等有關。見圖5。

4 討論

中藥指紋圖譜反映了該中藥的化學組成及其含量分布狀況，可實現對中藥的多組分和多指標分析。對鑒別藥材的真偽優劣及其穩定性均具有非常重要的參考價值。對中藥進行色譜方法的開發是建立指紋圖譜的關鍵步驟，同時也是耗時最長、耗費最大的一步。借助計算機輔助優化軟件DryLab，筆者在本實驗中對連錢草樣品進行了提取方法、流動相組成以及洗脫梯度程序，檢測波長等色譜條件進行了優化，完成了系統的方法學考察，建立了連錢草高效液相色譜指紋圖譜，并對連錢草高效液相色譜圖譜的相似度進行了評價。

采用夾角余弦為測度，聚類分析表明，10種不同產地、來源的連錢草可根據其指紋圖譜分成三大類，恩施，武漢，十堰，荊州1，對照品為一類，安徽，咸寧，貴州，咸寧，江蘇為一類，荊州2單為一類。10種湖北產地連錢草藥材有13個共有指紋峰，所含化學成分在組成上非常相似，但在含量方面仍存在一定差異，表明連錢草藥材的質量與其生長環境密切相關，與采收時間和栽培方式也有一定關系。因此，運用中藥指紋圖譜和指標成分定量相結合的方式，既可以完善表述中藥的整體特征，

又有別于西藥單一成分定量的質量控制模式。

表4 不同產地連錢草指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間Tab．4 Relative retention time of common peaks of Glechoma longituba＇s extraction from different resources

表5 不同產地連錢草指紋圖譜中各共有峰的相對峰面積Tab．5 Relative peak areas of common peaks of Glechoma longituba＇s extraction from different resources

圖5 10個產地連錢草提取物的色譜圖(檢測波長:0→60 min 330 nm，60→90 min 280 nm)Fig．6 Chromatograms of Glechoma longituba＇s extraction from ten different(Detection wavelength:0→60 min 330 nm，60→90 min 280 nm)

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