四黃軟膏質量標準研究*

黃毅，彭東洲，鄭維思，孫立敏，云玉瓊，譚紅，朱昊宇

(廣東省珠海市慢性病防治站，519000)

四黃軟膏是我站研制的外用軟膏，由黃芩、黃柏、大黃、硫磺等藥材組成，具有清熱燥濕、瀉火解毒、除濕止癢等作用，臨床上用于治療陰囊濕疹、慢性皮炎、毛囊炎等癥。為更好地控制該制劑質量，確保臨床使用安全有效，筆者對方中黃柏和大黃進行了薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)鑒別，并采用高效液相色譜法測定了制劑中黃芩苷的含量。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀，島津SPD-20A紫外檢測器，Sartorius BS分析天平(d=0.1 mg)，C5860A型超聲波清洗器(超聲頻率:40 kHz，超聲功率:180 W)，ZF-20型紫外線分析儀，層析用硅膠(青島海洋化工廠)。黃柏對照藥材(批號:121510-200703)、大黃對照藥材(批號:120984-200602)、黃芩苷對照品(批號:110715-200815)均購于中國藥品生物制品檢定所，四黃軟膏(本站提供，批號:20091208，20090914，20090728)，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃柏的TLC鑒別 取本品0.5 g，加無水乙醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為供試品溶液;取黃柏對照藥材0.06 g，加無水乙醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為對照藥材溶液;取陰性樣品(處方各味藥材，去黃柏，按四黃軟膏制備工藝制成)，同法制成陰性對照溶液;照TLC法(《中華人民共和國藥典》2010年版附錄Ⅵ B)實驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑，展開12 cm(展開溫度20℃，相對濕度65%)，取出，晾干，置紫外光燈(波長365 nm)下檢視(圖1)。供試品色譜中，在與對照藥材相應的位置上顯相同顏色的熒光主斑點(Rf分別為0.41和0.48)，而陰性對照色譜在相應的位置上無干擾。

2.2 大黃的TLC鑒別 取本品6 g，加水2 mL攪拌使分散均勻，加入甲醇30 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，加水20 mL、鹽酸2 mL溶解，水浴回流30 min，冷卻，用乙醚分2次振搖提取，每次15 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液;取陰性樣品(處方各味藥材，去大黃，按四黃軟膏制備工藝制成)，同法制成陰性對照溶液;取大黃對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。照TLC法(《中華人民共和國藥典》2010年版附錄ⅥB)實驗，吸取上述3種溶液各20 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開劑，展開12 cm(展開溫度20℃，相對濕度65%)，取出，晾干。置于365 nm波長紫外燈下檢視，結果見圖2。供試品色譜中，在與對照藥材相應的位置上顯相同顏色的熒光主斑點(Rf分別為0.40和0.57)，置氨氣中熏蒸后，顏色變深，而陰性對照品色譜在相應的位置上無干擾。

圖1 4種溶液的TLC圖譜1.黃柏對照藥材;2.陰性對照;3，4.樣品(批號:20091208)

圖2 6種溶液的TLC圖譜1，2.樣品;3，4.大黃對照藥材;5，6.陰性對照

2.3 黃芩苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:甲醇∶1%冰醋酸(60∶40);流速:1 mL·min-1;檢測波長:276 nm;柱溫:40℃;進樣量:10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每毫升約含0.1 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品(批號:20091208)0.5 g，精密稱定，置于10 mL燒杯中，加入水2.5 mL，50～60℃水浴中溫熱使其分散，放冷，轉移至25 mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，搖勻，高速離心，取上清液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 取處方量的除黃芩以外的各組分，按四黃軟膏制備工藝制成陰性樣品，再按“2.3.3”項方法制成陰性對照溶液。

2.3.5 系統適用性實驗 取上述對照品、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，照“2.3.1”項色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果，理論塔板數按黃芩苷峰計算為2 533;待測峰與其他組分峰分離度良好，拖尾因子及分離度分別為1.03和2.69，均符合《中華人民共和國藥典》2010年版要求，陰性無干擾，見圖3。

2.3.6 線性范圍考察 取黃芩苷對照品約10.0 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取該溶液6 mL置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;分別進樣 1，5，10，15，20 μL，記錄色譜圖，以對照品的量(X，μg)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=4E+06X-72 754，r=0.999 8，結果黃芩苷在0.06～1.20 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.3.7 加樣回收率實驗 取軟膏(批號:20091208，黃芩苷含量2.55 mg·g-1)0.25 g，共9份，置于10 mL燒杯，精密稱定，加水2.5 mL，在50～60℃加熱輕搖使分散均勻，轉移至25 mL量瓶，用甲醇分次洗滌容器，洗液轉入同一量瓶中，分別加入對照品使測定濃度分別達到待測樣品濃度的80%，100%和120%，加甲醇至刻度，搖勻，高速離心，取上清液，進樣10 μL，計算回收率，結果見表1。平均回收率100.96%，RSD=1.89%。

圖3 3種溶液的高效液相色譜圖A.陰性對照品;B.黃芩苷對照品;C.供試品;1黃芩苷

表1 四黃軟膏中黃苓苷加樣回收率實驗結果mg，n=6

2.3.8 精密度實驗 取“2.3.3”項同一供試品溶液，連續進樣6次依測定法進行測定，記錄黃芩苷色譜峰面積，結果RSD為0.55%。

2.3.9 重復性實驗 取同一批號樣品(批號:20091208)，按“2.3.3”項方法平行制備6份，按上述色譜條件測定。結果黃芩苷的平均含量為2.55 mg·g-1，RSD=1.10% 。

2.3.10 供試液穩定性實驗 取“2.3.3”項同一份供試品溶液，室溫放置，分別連續6 d測定黃芩苷的峰面積，結果表明，峰面積變化不大，RSD為0.68%，說明樣品在6 d內穩定。

2.3.11 3批樣品的含量測定 取3批四黃軟膏 (批號:20090728，20090914，20091208)，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣分析計算。結果3批樣品中黃芩苷含量分別為 2.41，2.65，2.55 mg·g-1。

3 討論

3.1 TLC展開劑 本實驗中黃柏、大黃鑒別中所采用的TLC展開劑分別參見2010年版《中華人民共和國藥典》平肝舒絡丸及狼瘡丸鑒別項下的相關條件。

3.2 供試品溶液制備方法的優選 《中華人民共和國藥典》2010年版收載的測定中成藥(丸劑、片劑或顆粒劑)中黃芩苷時，采用的溶劑有50%甲醇、70%乙醇或稀乙醇等;提取方法常采用回流或超聲的方法。筆者在本研究中考察了不同溶劑、不同提取方法以及不同提取時間對黃芩苷的提取情況，發現軟膏輔料及制劑中硫磺對黃芩苷的提取有較大的影響。

3.2.1 提取溶劑的優選 筆者考察了甲醇、甲醇-水(60∶40)和50%甲醇3種溶劑，經超聲、回流相同時間后，測定黃芩苷峰面積，依次1 815 242，1 806 010和1 572 742，表明以甲醇或甲醇∶水(60∶40)作為提取溶劑均較好。

3.2.2 提取方法的優選 筆者曾以甲醇為溶劑，考察采用直接超聲提取法、水浴回流提取法以及先用少量水分散再超聲提取法對黃芩苷的提取的影響。實驗結果表明:加入甲醇后振搖，樣品保持團塊狀不易分散;另外可能因本品中含有硫磺，不論是加熱還是超聲，都易引起樣品聚集成團的現象，影響測定，且需60 min以上超聲或回流后才能提取完全;如果利用軟膏劑中含有較多的表面活性劑，加入少量水略微加熱一下，樣品就很容易分散，加入甲醇后仍能保持較好的分散狀態，此時以及繼續分別超聲處理10，20和30 min的樣品，峰面積基本相同，同時也與回流1 h以上的峰面積一致，說明采用先用少量水分散再加入甲醇混勻后的樣品，即使不超聲黃芩苷也能較好的提取出來，且操作起來簡便，快速。

3.3 流動相的優選 參照2010年版《中華人民共和國藥典》雙黃連片含量測定項下所用流動相(有機相為甲醇，水相為2%醋酸)，并對水相和有機相的比例進行適當調整，考察其對樣品分離度的影響，結果在水相從45%增加至55%，黃芩苷和相鄰峰均不能得到很好的分離，當增至60%時，雖然可與相鄰峰分開，但峰形不對稱。調節水相為1%冰醋酸，并考察不同比例水相和有機相對樣品分離情況的影響，結果分離度及峰形均明顯改善，分離度達到要求，且峰形對稱。最終確定流動相為甲醇∶1%醋酸(60∶40)。

3.4 檢測波長的選擇 檢測波長的選擇參照2010年版《中華人民共和國藥典》雙黃連片和芩暴紅止咳片黃芩苷含量測定項下所用波長，其流動相組成相近。

盡管在《中華人民共和國藥典》2010年版及一些文獻中收載了黃芩苷的含量測定法，但有關在軟膏劑中的含量測定的方法報道較少。筆者在研究中發現，由于軟膏中含有大量的油相、表面活性劑和水，以及本制劑中含有的硫磺，對黃芩苷的提取影響較大，如果采用常用固體制劑的樣品處理方法，難以收到理想的效果。筆者在本實驗中根據四黃軟膏的特點，對供試品溶液的制備方法進行了改進，方法簡便易行，對其他軟膏劑的樣品處理有一定的借鑒作用。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:554，566，612，638，737.

［2］ 陳毅新，劉杜妙.四黃正骨水的薄層色譜鑒別及微生物限度檢查［J］.中國藥業，2009，18(12):45-46.

［3］ 楊立偉，龍飛，肖樹雄.HPLC法測定消炎清熱膠囊中黃芩苷的含量［J］.中國藥房，2008，19(21):1632-1634.