鮑曼不動桿菌OXA基因的檢測及ISAba1對其表達的影響

孫艷霞，聶大平

(1. 盤錦市第一人民醫院 檢驗科,遼寧 盤錦 124010; 2. 大連醫科大學 附屬第二醫院 檢驗科,遼寧 大連 116027)

鮑曼不動桿菌(Acinetobater baumannii, AB)是一種臨床常見的條件致病菌，在院內感染中占有很大比重，廣泛存在于自然界及人體的呼吸道、口腔、黏膜、皮膚等部位，引起菌血癥、肺炎、傷口感染、泌尿系等的重度感染[1]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，多藥耐藥的鮑曼不動桿菌在世界范圍內暴發流行的趨勢日益嚴重，尤其在重癥監護病房[2]及燒傷病房[3-4]，給臨床治療帶來極大困難。鮑曼不動桿菌耐藥機制是多方面的，如β-內酰胺酶的產生，藥物流出泵的形成，外膜蛋白的改變，整合子的作用等，其中對亞胺培南的耐藥主要是由于產生了碳青霉烯酶。OXA-23，OXA-24，OXA-51，OXA-58基因在臨床分離的鮑曼不動桿菌中較常見，而其表達依賴于OXA基因上游的插入序列1(ISAba1)提供強啟動子[5]。本實驗通過對臨床110株鮑曼不動桿菌OXA基因的研究及探討ISAba1對OXA-23表達的影響，了解其耐藥機制，期待其能在臨床治療及控制耐藥株的產生和擴散等方面提供有力依據。

1 材料和方法

1.1 臨床菌株

110株鮑曼不動桿菌(其中對亞胺培南敏感株為13株，耐藥株為97株)于2008年7月-2010年3月分離自大連醫科大學附屬第二醫院及大連市第三人民醫院住院患者，無重復株。常規鑒定菌種，紙片擴散法進行藥敏試驗。

1.2 標準菌株及抗菌藥物

質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853；轉化的感受態細胞為大腸埃希菌TOP10(購自天根生化公司) 。

抗菌藥物：藥敏紙片購自OXOID公司，亞胺培南/西司他丁(IMP)購自美國默克公司。

1.3 主要分子生物學試劑

2×Taq PCR Master Mix，普通DNA產物純化試劑盒，pGM-T克隆試劑盒均購自天根生化公司；250 bp DNA Ladder Marker，溴乙錠(EB)，MH瓊脂，瓊脂糖均購自大連寶生物工程有限公司；PCR引物[1]合成，測序均由大連寶生物工程有限公司完成。本實驗中所用引物見表1。

1.4 耐藥基因檢測方法

1.4.1 模板DNA的制備: 模板煮沸法制備PCR擴增模板：將在M-H平板上培養過夜的細菌菌落混懸于2 mL的8.5 g/L的NaCl中，使成5個麥氏單位，13000 r/min離心2 min，沉淀重懸于200 μL無菌重蒸餾水，并置K10CD干式恒溫器煮10 min。13000 r/min離心10 min，取上清液保存于-20 ℃備用[1]。

1.4.2 PCR擴增 (采用25 μL體系): 多重PCR檢測OXA基因(blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、 blaOXA-58-like)：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s,54 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸6 min。

同源性分析(腸桿菌科基因組內重復序列聚合酶鏈反應ERIC-PCR)：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性60 s,58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸6 min。

ISAba1-OXA-23、ISAba1-OXA-51、OXA-23、OXA-51基因完整序列的擴增：取非同源性鮑曼不動桿菌以ISAba1上游引物和OXA-23、OXA-51下游引物分別擴增ISAba1-OXA-23 、ISAba1-OXA-51，同時取OXA-23、OXA-51上下游引物擴增OXA-23,OXA-51。94℃預變性4 min；94 ℃變性50 s,52 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳: PCR產物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min，Marker為250 bp DNA Ladder Marker，凝膠置300 nm紫外燈下觀察結果，并進行凝膠成像系統掃描成像。

1.4.4 PCR產物純化: 用天根生化公司普通DNA產物純化試劑盒，按說明書進行PCR產物純化。

1.4.5 基因序列: OXA-23，OXA-51，OXA-58，ISAba1-OXA-23完整序列測定由大連寶生物工程有限公司完成，并與GENBANK注冊的相應基因序列進行比對。

表1 PCR擴增引物

1.5 轉化實驗

1.5.1 PCR產物連接: PCR產物OXA-23及ISAba1-OXA-23使用pGM-T連接試劑盒按照產品說明書連接。

1.5.2 連接產物轉化: 連接后質粒使用pGM-T轉化試劑盒按照產品說明書轉化。

1.6 亞胺培南/西司他丁對實驗菌株的MIC測定

亞胺培南(西司他丁)對實驗菌株及轉化子采用瓊脂對比稀釋法測定其MIC，對照CLSI規定的MIC標準判定耐藥、中介、敏感。

2 結 果

2.1 多重PCR檢測OXA-碳青霉烯酶編碼基因

多重PCR檢測到OXA-23，OXA-51，OXA-58基因，未檢測到OXA-24基因。110株鮑曼不動桿菌OXA基因檢出與對亞胺培南耐藥的關系見表2 。

多重PCR電泳結果見圖1。OXA-碳青霉烯酶基因在鮑曼不動桿菌中廣泛存在，以OXA-23、OXA-51為主，OXA-58較為少見，尚未發現OXA-24；臨床上同時攜帶OXA-23和OXA-51兩種基因的鮑曼不動桿菌較多見。

表2 110株鮑曼不動桿菌OXA基因檢出與對IMP耐藥的關系

2.2 同源性分析

110株菌株中有18個克隆株。其中，第2孔道菌株為流行株，110株臨床分離的菌株中有51株為該菌株，占實驗總菌數的46.36%，并且分離自多個病區的多種標本，其它菌株散在分布,結果見圖2。

2.3 轉化實驗結果

2.3.1 PCR擴增OXA基因完整序列: 選取非同源的臨床實驗菌株進行OXA基因完整序列擴增，得到OXA-23、OXA-51、ISA-OXA-23基因序列，長度分別為1067 bp、825 bp、2036 bp,未擴增出ISA-OXA-51基因序列，選取的12株OXA-23陽性中對應擴增出ISA-OXA-23陽性菌株9株，見圖3。

圖1 多重PCR擴增OXA基因

圖2 同源性分析

圖3 轉化子和對應臨床分離菌株PCR擴增片段

2.3.2 耐藥基因序列測定: 隨機選取ISAba1-OXA-23，OXA-23，OXA-51實驗菌株PCR產物由大連寶生物工程有限公司測序，結果經GenBank網上同源性比較，分別與注冊號為GQ861439.1，EF534259.1，GQ914991.1的鮑曼不動桿菌一致，一致性分別為100%，100%和100%。

2.3.3 轉化實驗：分別將轉化子OXA-23，ISAba1-OXA-23進行相應PCR擴增，其產物與對應的臨床菌株PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到的片段長度與對應的臨床實驗菌株片段大小一致，見圖3。

2.4 亞胺培南對臨床菌株及轉化子的MIC結果

臨床實驗菌株OXA-23、ISA-OXA-23 和OXA-51 MIC值分別為256、128、128；TOP10(pGM ISAba1-OXA-23)MIC值為0.5，另一轉化子TOP10(pGMOXA-23)MIC值為0.125，TOP10(pGMOXA-51)MIC值為0.25。

3 討 論

多藥耐藥的鮑曼不動桿菌已經作為一個廣泛流行的臨床問題出現[9]，這種趨勢與包括鮑曼不動桿菌在內的院內感染的不動桿菌屬的流行具有一致性。來自美國全國醫院感染監控系統的數據顯示，該國的重癥監護病房(ICU)內與不動桿菌屬相關聯的肺炎感染率從1983年的3%上升至2003年的7%[10]。耐碳青霉稀類的鮑曼不動桿菌于1991年首先在美國被發現，隨后報道了多起由耐亞胺培南的AB引起的醫院暴發流行。近年來，該菌在呼吸道的分離率在30%以上[11]。碳青霉烯酶OXA-23的產生是鮑曼不動桿菌多重耐藥的最常見機制[12]。在歐洲，其耐藥程度明顯與插入序列ISAba1提供的強啟動程序導致碳青霉烯酶的過表達有關[13]；在歐美地區，觀察到不同的帶有ISAba1和OXA-23結構的轉座子的結構支持這一假說，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物高水平耐藥基因可能是其通過轉座子基因介導的基因轉移從與其共生的生物體獲得。

本研究在110株菌中檢測到單純OXA-23陽性率為8.18%(9/110)；單純OXA-51陽性率為10.91%(12/110)；OXA-58陽性率為1.82%(2/110)；OXA-23和OXA-51同時陽性率為75.45%(83/110)；未檢測到OXA-24。上述菌株對亞胺培南的耐藥率高達87.27%，說明鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物具有極高的耐藥率。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制主要包括：產生B類、D類β-內酰胺酶，外膜蛋白(OMP)的丟失，青霉素結合蛋白(PBP)的改變及外排機制[14]。為了探討ISAba1對OXA類酶表達的影響，本實驗分別將不帶有ISAba1和帶有ISAba1序列的OXA-23片段轉化到大腸埃希氏菌TOP10中，以避免B類、D類β-內酰胺酶，外膜蛋白(OMP)的丟失，青霉素結合蛋白(PBP)的改變及外排機制等因素對于鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥的影響，通過比較兩株轉化子對亞胺培南的最低抑菌濃度的不同來觀察ISAba1對OXA酶表達的影響。結果顯示，兩者的MIC分別為0.125和0.5，并無明顯差別。而Lin YC等[15]將ISAba1-bla(OXA-23) 和 ISAba1-bla(OXA-66)分別轉化到A. baumannii ATCC 15151 (CIP 70.10)中，可導致OXA-23，OXA-66的高表達。表明在鮑曼不動桿菌中 ISAba1為blaOXA-23的表達提供強啟動子。但在大腸埃希菌中，ISAba1的存在并未對OXA酶的表達產生影響，這可能是該菌的內部環境不能滿足ISAba1啟動OXA-23基因的條件所致。

OXA-51是鮑曼不動桿菌的重要標志[16]。本文OXA-51陽性為95株，表明86.3%的菌株可確定為鮑曼不動桿菌，單純OXA-51耐藥、OXA-23耐藥OXA-58耐藥的情況均有報道[17]，本實驗中，不含OXA基因、單純OXA-23、OXA-51基因耐藥的臨床菌株分別為1.82%、7.27%、7.27%，未檢測到單純OXA-58的耐藥菌株。并且在檢測的12株OXA-23陽性的耐藥菌株中，有9株檢測到ISAba1基因序列，這些都表明ISAba1對OXA-23表達可能起重要作用,同時也存在其他機制。

大連地區鮑曼不動桿菌對碳青霉烯耐藥主要原因是產生OXA-23基因。ISAba1位于OXA-23基因的上游,大腸桿菌中單純OXA-23基因和有ISAba1-OXA-23片段未對OXA酶的表達產生大的影響。

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