HPLC法測定鐵皮石斛飲料中D-甘露糖的含量

楊兵勛，沈春香，王 增，陳立鉆，樓正家，吳人照，夏克中

(浙江天皇藥業有限公司，浙江 杭州 310012)

HPLC法測定鐵皮石斛飲料中D-甘露糖的含量

楊兵勛，沈春香，王 增，陳立鉆，樓正家，吳人照，夏克中

(浙江天皇藥業有限公司，浙江 杭州 310012)

目的：建立鐵皮石斛飲料中D-甘露糖(D-Man)含量的測定方法。方法：樣品分別經乙醇沉淀、鹽酸水解和衍生化處理。色譜柱使用Agilent EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)； 20mmol/L乙酸銨-乙腈溶液(80.5: 19.5)為流動相；流速1.0mL/min；檢測波長250nm。結果：樣品中西洋參多糖對甘露糖含量測定無干擾；樣品中D-甘露糖在7.815～312.6μg/mL 范圍內，線性關系均良好，相關系數r=0.9997；樣品回收率為99.66%，RSD為1.76%(n=6)。結論：本方法專屬性強、靈敏、精確、重現性好，可用于本品多糖組成中D-Man含量的測定。

鐵皮石斛飲料；D-甘露糖；高效液相色譜法；含量測定

鐵皮石斛飲料(Dendrobium officinale Kimuraet Migo beverage，DOB)主要原料為鐵皮石斛和西洋參，是采用水提等制備工藝制備而成的保健飲料，具有養胃生津、滋陰降火、提高機體免疫功能的功效，其主要功效成分為鐵皮石斛多糖。文獻報道，鐵皮石斛多糖主要含有多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，相對分子質量分別為1000000、500000和120000，多糖水解物主要含甘露糖(Man)、葡萄糖，還含有微量的阿拉伯糖和木糖[1-4]。Man等單糖成分多為己糖結構，在紫外區無吸收，直接采用紫外法或HPLC法無法測定。目前對Man等單糖類成分多采用示差折光檢測器，但示差檢測器檢測靈敏度低，且不能梯度洗脫[5]。本研究采用先將DOB中鐵皮石斛多糖水解成單糖，并與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進行衍生化后，再行HPLC法測定DOB中D-Man的含量。該方法專屬性強、重現性好，旨在為功能性飲料品控提供一種有效的控制手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鐵皮石斛飲料(批號：091021-1)及缺鐵皮石斛的陰性制劑飲料 浙江天皇藥業有限公司。

乙腈(色譜純) 德國Merck公司；對照品D-甘露糖(D-Man) (批號：200301，含量：99%) 中國藥品生物制品檢定所；內標鹽酸氨基葡萄糖(HAG，純度99.0%～101.0%) 國藥集團化學試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，分析純) 上海晶純試劑有限公司。水為亞沸高純水(自制)；其余試劑均為分析純。

1100液相色譜儀、色譜工作站(A.09.01版) 美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取D-Man對照品、內標HAG適量，加水制成每1mL含D-Man 0.1mg、內標鹽酸氨基葡萄糖0.1mg的溶液，并進行衍生化，分離收集上清液，即得對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

樣品提取：精密吸取鐵皮石斛飲料1mL于具塞試管中，精密加入無水乙醇4mL，放置1h，4000r/min離心20min，倒出上清液，再加入80%乙醇溶液5mL洗滌，4000r/min離心20min，倒出上清液，沉淀置水浴揮去殘留乙醇，再精密加入內標HAG溶液(0.2mg/mL)3mL，水浴溶解混勻，得多糖樣品提取液。

樣品水解：取含多糖樣品提取液1mL置于安瓿瓶中，加3mol/L HCl溶液0.5mL，封口，110℃反應1h，冷卻后用NaOH中和至中性，得樣品水解液。

樣品衍生化：取樣品水解溶液、0.3mol/L NaOH溶液、0.5mol/L PMP甲醇溶液各400μL，置于具塞離心管中，密塞，70℃衍生化反應100min，放冷，加0.3mol/L HCl溶液0.5mL，用2mL三氯甲烷萃取，共2次，水層液離心，收集上清液，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：20mmol/L乙酸銨-乙腈溶液(80.5:19.5)；流速：1.0mL/ min；柱溫：30℃；檢測波長：250nm；進樣量10μL。

2 結果與分析

2.1 專屬性實驗

取缺鐵皮石斛的陰性制劑飲料，照1.2.2節方法制備缺鐵皮石斛飲料陰性對照溶液；分別吸取對照品、供試品和缺鐵皮石斛飲料陰性對照溶液各10μL，分別進樣，進行色譜測定。結果發現，色譜峰分離度良好，且陰性對照溶液對D-Man的測定無干擾(圖1)，表明本法專屬性強。

圖1 Man HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of iron free DOB (containing no internal standard), control (containing no internal standard), test sample and control (containing internal standard)

2.2 重復性實驗

取鐵皮石斛飲料，照1.2.2節方法分別制備6份樣品，按1.2.3節色譜條件進行測定，結果所測D-Man的峰面積RSD為0.72%，表明本法重復性好。

2.3 精密度實驗

取同一對照品溶液連續進樣6針，測定D-Man峰面積，其RSD為0.29%，說明儀器的精密度符合要求。

2.4 穩定性實驗

取供試品溶液連續5d進樣測定D-Man峰面積，結果5d所測結果RSD為0.18%，表明本樣品溶液在室溫條件下5d內是穩定的。

2.5 線性關系考察

分別配制質量濃度為0.007815、0.015630、0.031260、0.062520、0.125040、0.312600mg/mL的D-Man工作溶液，內含鹽酸氨基葡萄糖質量濃度為0.12186mg/mL，按1.2.2節方法分別進行衍生化，并按照1.2.3節色譜條件測定DMan峰面積。以D-Man質量濃度(C，mg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線圖，其回歸方程為：A=1.3641C-0.0239，r=0.9997，說明D-Man在7.815～312.6μg/mL范圍內，線性關系均良好。

2.6 回收率實驗

精密吸取鐵皮石斛飲料6份，每份各 0.5mL，分別置于具塞試管中，按照1.2.2節方法提取，向提取物中各精密加入內標鹽酸氨基葡萄糖溶液0.12186mg/mL、DMan 0.06252mg/mL 的混合溶液3mL，再按照1.2.2節方法制備樣品。最后按1.2.2節色譜條件測定D-Man峰面積，并計算回收率(表1)。結果顯示，6份樣品所測平均回收率為99.66%，RSD為1.76%，表明本方法回收率符合要求。

表1 回收率實驗結果Table 1 Spike recovery of the method

2.7 樣品中D-Man含量的測定

取不同批號的鐵皮石斛飲料，按1.2.2節方法處理，照1.2.3節色譜條件測定，并計算產品中D-Man的含量，結果見表2。

表2 鐵皮石斛飲料中D-Man含量測定結果(n=3)Table 2 Man concentrations in different batches of DOB determined by HPLC (n=3)

3 討 論

DOB是采用水提等制備工藝將鐵皮石斛和西洋參制備而成的保健飲料，其主要活性成分為鐵皮石斛多糖。D-Man是鐵皮石斛多糖主要構成成分之一，其分子為己糖結構，在紫外區無吸收，直接采用紫外法或HPLC法無法測定。目前對Man等糖類成分多采用示差折光檢測器，但示差檢測器檢測靈敏度低，且不能梯度洗脫。通過衍生化使糖類化合物生成具有紫外吸收或能發射熒光的物質是提高糖類HPLC檢測靈敏度的主要手段[5-7]。

Man與PMP中吡唑啉酮基作用生成PMP-Man衍生物，衍生物中含有苯基結構，在250nm波長處有強紫外吸收。同時，衍生化后改變了糖的化學結構，更有助于分離。本研究采用先將DOB中鐵皮石斛多糖水解成單糖后與PMP進行衍生化，再行HPLC法測定D-Man的含量。結果顯示，本法不僅靈敏、專屬性強、分離度高，可適用于本品質控，而且采用先將鐵皮石斛多糖水解成單糖后再測定D-Man的含量，避免了制劑中人為加入的干擾。

本研究對鐵皮石斛多糖水解條件進行比較，結果顯示，對本法制樣量用3mol/L HCl 0.5mL，110℃反應1h即可水解完全；此外，本研究還對D-Man衍生化的條件進行了優化，結果表明，采用本實驗衍生化條件可使D-Man衍生化反應徹底。

鐵皮石斛多糖是鐵皮石斛的主要活性成分，含量高達29%以上[8-9]。文獻報道，石斛類藥材還含有微量的石斛堿、石斛醚、毛蘭素、鼓槌聯芐等小分子物質[10-15]；目前，鐵皮石斛藥材及其制劑僅采用硫酸苯酚顯色法測定多糖含量進行質量控制。該法顯著缺點是不能準確判斷所測多糖的來源，即鐵皮石斛多糖，專屬性差；最近，比較研究32種石斛中多糖含量、多糖構成等，結果發現，鐵皮石斛多糖中的D-Man、葡萄糖、半乳糖具有較恒定的比例關系。鐵皮石斛多糖中以上3種單糖質量比為140:35:1，且主要單糖構成不同于其他石斛(另文發表)。因此，對DOB以及鐵皮石斛類其他制劑采用測定多糖、多糖中主要單糖的含量及其比例關系等綜合手段將是未來鐵皮石斛類制劑質量控制發展的方向之一。

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Determination of Mannose in Dendrobium officinale Kimuraet Migo Beverage by HPLC

YANG Bing-xun，SHEN Chun-xiang，WANG Zeng，CHEN Li-zuan，LOU Zheng-jia，WU Ren-zhao，XIA Ke-zhong
(Zhejiang Tianhuang Medicinal Plant Pharmaceutical Co. Ltd., Hangzhou 310012, China)

Objective: To establish a HPLC method to determine the content of D-mannose (D-Man) in Dendrobium officinale Kimura et Migo beverage (DOB). Methods: Ethanol precipitation followed by hydrochloric acid hydrolysis and derivatization was carried out for sample preparation. Mannose was separated on an Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5μm) using a mobile phase made up of 20 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (80.5:19.5, V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm. Results: No interference was found from Panacis quinquefolium in DOB. The linear range of Man was between 7.815μg/mL and 312.6μg/mL (r = 0.9997). The average recovery was 99.66% (RSD 1.76%, n = 6). Conclusion: This method is specific, sensitive, accurate and reproducible and may therefore be applicable for the determination of D-Man in DOB.

Dendrobium officinale Kimura et Migo beverage；D-mannose；HPLC

R917

A

1002-6630(2011)08-0275-03

2010-06-25

楊兵勛(1963—)，男，高級工程師，博士，主要從事藥品及保健食品研究。E-mail：Yangbx001@yahoo.com.cn