痛瀉要方對內臟高敏感大鼠腦干孤束核CGRP表達的影響

蔣 霞 潘 鋒 陳建永 浙江省中西醫結合醫院消化內科 杭州 310003

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是以腹部疼痛或不適為主，伴有大便性狀或排便習慣改變，持續存在或間歇發作，無形態學和生化異常改變的征候群。目前研究表明，50%～70%的IBS患者腸道疼痛閾值低于正常，其腸道處于高敏感狀態，而內臟感覺的高敏感性可能與神經調節和傳遞介質釋放失調或感覺神經末梢對這些介質的敏感性增高有關。降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）作為神經傳遞和調節介質，是疼痛感覺及痛覺過敏產生所必需的物質，在調節內臟感覺和運動中起重要作用。呂賓等[1]在內臟高敏感大鼠的腦干多個核團中發現CGRP表達有明顯增加。我們應用痛瀉要方干預內臟高敏感大鼠，觀察其腦干孤束核CGRP表達的變化，以探討痛瀉要方的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF級雄性Wistar大鼠56只，體重180～200g，清潔級，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供（實驗動物生產許可證：SYXK（浙）2008-0115）。所有動物在有恒溫、恒濕及晝夜光線變化的房間里分籠飼養，自由進食、進水，適應性飼養1周后開始實驗。

1.2 藥 物 番瀉葉購自浙江省醫藥公司（杭州桐君堂中藥飲片廠）。將番瀉葉置60℃烘箱中密封水浸泡12h，紗布過濾濃縮為100%濃度，4℃儲存備用。痛瀉要方顆粒劑（含白芍、防風、白術各12g，陳皮6g，江蘇江陰天江藥業有限公司生產）用滅菌蒸餾水按1∶1沖兌，4℃儲存備用。將得舒特（通用名：匹維溴銨，法國蘇威特制藥公司，批號H20070059，50mg/粒）用研缽研細，100目過篩，用滅菌蒸餾水按1∶1沖兌，4℃儲存備用。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 將大鼠隨機分為正常組、模型組、治療組、對照組，每組14只。適應性喂養1周后，模型組、治療組、對照組先灌服番瀉葉煎劑10g/kg，1天1次，連續2周；2周后加用束縛桶束縛大鼠肩部、前肢及胸部，限制大鼠用前肢搔抓頭面部，但不限制其活動，束縛時間為1h，1天1次，連續2周。

2.2 藥物干預 自第4周起，模型組予0.15mL生理鹽水灌胃，治療組予0.15g/0.15mL痛瀉要方水溶液灌胃，對照組予3mg/0.15mL得舒特水溶液灌胃，連續2周。正常組大鼠同步飼養，予等劑量生理鹽水灌胃6周。

2.3 標本采集 第6周末，在25%烏拉坦腹腔麻醉下，開胸，暴露心臟，從左心室插管至升主動脈，經升主動脈用500mL生理鹽水灌流沖洗血液，并剪開右心耳，至肝臟完全變白，從右心耳流出無色的沖洗液后，再用新鮮配置的固定液（含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液）500mL灌流，至四肢、脊柱變硬（時間約40min），立即取腦，在上述固定液中固定2～4h（4℃），再移入含30%蔗糖的PB液內直至組織沉淀（4℃），沉淀時間約48h。取出后在大腦腳底做一冠狀切面，剝離小腦，將腦干做冰凍連續冠狀切片，片厚30μm，隔6取1，收集于三套玻片上，分別做CGRP免疫組化、陰性對照及Nissl染色。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 評估腸道敏感性[2]6周后，采用直結腸擴張刺激的方法觀察大鼠腹部回縮反射。每組隨機選取6只大鼠，乙醚麻醉下，用石蠟油潤滑后的動脈栓子清除術導管經肛門插入，氣囊末端距離肛門1cm，用膠布把導管和鼠尾根部纏在一起以固定氣囊，將大鼠放入只能前后運動的透明籠中，待大鼠適應環境后，向囊內逐漸注水擴張腸道，觀察大鼠腹部抬高（3分）及背部拱起（4分）時的容量閾值，進行評估。為得到準確數據，每次操作重復3次，數據取平均值。

腹部回縮反射（Abdominalwithdrawal reflex，AWR）行為評分標準為：0分，大鼠情緒基本穩定，無行為學反應；1分，大鼠情緒不穩定，扭動頭部；2分，大鼠腹背部肌肉輕微收縮，但腹部未抬離地面；3分，大鼠腹背部肌肉較強收縮，腹部抬離地面；4分，大鼠腹背部肌肉強烈收縮，背部呈弓形并把腹部、骨盆及會陰部抬離地面。1分看作是大鼠的感覺容量閾值，2分作為痛覺敏感閾值，4分作為痛覺最大耐受容量閾值。觀察大鼠達到3分和4分行為標準時的注水量，通過注水量反應其腸道的敏感性，腸道敏感性越高，達到3分、4分行為標準者注水量越少。

2.4.2 評估腹壁緊張度 每組隨機選取6只大鼠，用苯巴比妥（30mg/kg）麻醉，將一銀制雙極電極縫合到腹股溝韌帶上方、距中線1.5cm的一側腹外斜肌上。電極的游離端經皮下隧道置于頸后，用膠布固定。手術后5天開始肌電記錄。乙醚麻醉下，將上述球囊導管經肛門插入直腸內，球囊末端距離肛門1cm，電極導線的兩端連接電生理記錄儀。大鼠蘇醒30min后，分別在 0、0.5、0.8、1.6mL 容量下進行直腸擴張。每次膨脹持續5min，記錄5min內腹壁收縮數量，每次擴張結束時，將水回抽，檢測球囊有無漏水。用PowerLab電生理記錄儀記錄腹壁肌電活動，高頻濾過設置為10Hz，低頻濾過為1kHz，電壓1mV。肌電活動增高超過基線水平100μV以上認為是1次有意義的腹壁收縮活動。

2.4.3 免疫組化ABC法 大腦片經0.3%H2O2的甲醛溶液處理30min，然后用0.01%mol/L的PBS洗滌4次，加入抗體稀釋液37℃恒溫箱中孵育1h，再加1：2000 兔抗鼠 CGRP（購自 Sigma公司 c8198），4℃冰箱72h，PBS洗滌4次，加1：200的生物素化羊抗兔抗體（購自sigma公司B7389），4℃冰箱48h，PBS洗滌4次，加1：200鏈霉親和素－辣根過氧化物酶復合物（購自 sigma公司 PK-4000），4℃冰箱 24h，PBS洗滌4次，室溫（20℃左右）下加 DAB 顯色 10～15min，PBS洗滌中止反應，室溫下干燥，85%、90%、95%、100%、100%、100%酒精上行逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。用PBS代替一抗，進行空白對照，同步進行上述免疫組化染色，結果為陰性。

Nikon ECLIPSE E-600電子顯微鏡觀察，在目鏡上放置正方形網格，記錄鏡下（10×40倍）一個網格所覆蓋面積下的陽性細胞數，折算成每平方毫米的陽性細胞數，并照相。

2.5 統計學方法 各核團單位面積CGRP陽性細胞數結果以（） 表示。應用SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Tambane’S T2法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 大體觀察 正常組大鼠體重明顯增加，大便正常，耗食量正常。其余各組大鼠均出現不同程度體重增長緩慢或下降：治療組大鼠于第2～3天開始出現煩躁、大便次數增多、大便水分增多；對照組大鼠第2天開始出現大便次數增多、稀便、肛門口污穢、拱背、萎靡、蜷臥少動、喜聚堆等表現；模型組大鼠兼有以上兩組表現，大便完全為稀便，大鼠嗜臥扎堆，毛色無華、變脆。

3.2 各組大鼠腸道敏感性和腹壁緊張度比較 正常組、治療組、對照組大鼠腹部回縮反射直腸擴張容量比較差異無統計學意義（P＞0.05），但與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。不同直腸擴張強度下大鼠腹壁收縮次數比較見表2。

表1 各組大鼠腹部回縮反射直腸擴張容量比較（） mL

表1 各組大鼠腹部回縮反射直腸擴張容量比較（） mL

注：與模型組比較，△P＜0.05。

組 別 n/只 腹部抬高 背部拱起正常組 6 0.65±0.09△ 1.04±0.12△模型組 6 0.42±0.05 0.60±0.04治療組 6 0.70±0.06△ 1.06±0.18△對照組 6 0.68±0.08△ 1.05±0.07△

表2 不同直腸擴張強度下大鼠腹壁收縮次數比較（） 次/5min

表2 不同直腸擴張強度下大鼠腹壁收縮次數比較（） 次/5min

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 n/只 0.5mL 0.8mL 1.6mL正常組 6 0.63±0.02△ 3.67±1.32△△ 15.90±4.23模型組 6 5.63±0.16 9.10±1.35 17.60±3.76治療組 6 0.63±0.03△ 4.23±1.46△△ 16.78±4.12對照組 6 0.65±0.02△ 4.45±1.31△△ 16.45±4.28

3.3 免疫組化結果 典型的CGRP免疫陽性神經元表現為胞漿染色呈棕褐色，胞核不著色，神經元呈現空泡狀。每組大鼠腦干孤束核均表達CGRP免疫陽性神經元，呈雙側分布，組間表達有差異。正常組、模型組、治療組、對照組四組大鼠腦干CGRP免疫陽性神經元個數分別為 83.87±9.54 個/mm2、125.89±14.93個/mm2、97.18±12.49 個/mm2、91.52±10.76 個/mm2。正常組、治療組、對照組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

電鏡下各組大鼠孤束核CGRP表達見圖1～4。

4 討 論

已有研究[3]發現，CGRP與痛覺信號的傳遞有密切關系，脊髓蛛網膜下腔注射CGRP可使痛閾降低，它可以通過促進SP的釋放而有利于痛覺的傳遞。在甲醛致痛實驗中，發現投射到脊髓背角淺層的初級傳入神經末梢中的CGRP樣免疫活性物質明顯增多；佐劑性關節炎痛時，脊髓背根神經節（DRG）神經元內CGRP-mRNA表達明顯增強；鎮痛藥可使DRG內CGRP免疫活性物質含量和脊髓內釋放CGRP明顯減少，并可使痛覺過敏程度減輕[4]，上述實驗均提示CGRP參與了痛覺信息的傳遞及痛覺過敏的形成。我們既往研究發現[1]，CGRP在內臟高敏感大鼠腦干多個核團的表達增加，尤其是孤束核的表達明顯增加，提示高級神經中樞可以通過調控CGRP在腦干核團的表達參與痛覺過敏的形成。

孤束核是一個位于延髓背側，包繞于孤束周圍的Y字形柱狀核團，它有廣泛的傳入傳出聯系，是內臟的初級傳入及調節中樞，與胃腸道活動的調節以及鎮痛等多種功能有關。孤束核的上端能夠接受來自味覺的初級感覺纖維，其余各部分則接受來自臟器和心血管等的初級感覺纖維，這些纖維進入核團以前在腦干內形成縱行的孤束，孤束核的細胞分布于孤束周圍并接受其纖維的終止，直接參與調控內臟活動。另外，作為中轉站，孤束核的上行傳遞系統既能傳入大腦皮質，又能間接聯系邊緣系統，通過更高級別中樞神經系統參與內臟運動。

本實驗顯示，經過灌服番瀉葉煎劑加束縛桶限制活動后，大鼠的痛閾明顯降低，直腸注水量明顯減少，在孤束核CGRP的表達明顯增多，其腸道的敏感性增加，而經過痛瀉要方灌胃后的大鼠痛閾明顯上升，孤束核CGRP表達明顯減少，腸道敏感性下降，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），與正常對照組比較無統計學意義（P＞0.05）。提示痛瀉要方可能通過減少高級神經中樞孤束核CGRP的表達而發揮減輕痛覺過敏的作用。

本組結果顯示，孤束核作為內臟感覺刺激傳入通路的終止處以及中轉站，參與了疼痛刺激信息的傳遞及調控，痛瀉要方可以減輕內臟敏感性，減少大鼠痛覺過敏的形成，而降低孤束核CGRP的表達可能是其作用機制之一。

［1］呂賓，蔣霞.內臟高敏感大鼠腦干降鈣素基因相關肽、c-fos基因表達的研究［J］.胃腸病學，2007，12（11）：681-684.

［2］劉雁冰，袁耀宗.大鼠腸道高敏性模型的建立及其內臟敏感性評估［J］.中華消化雜志，2003，23（1）:34-37.

［3］Christensen MD，Hulsebosch CE.Spinnal cord injury and anti NGF treatment results in changes in CGRP density and distribution in the dorsal horm in the rat［J］.Exp Neurol，1997，147（2）：463-475.

［4］Ballet S，Aubel B，Mauborgne A，et al.The novel analgesic，cizolirtine，inhibits the spinal release of substance P and CGRP in rats［J］.Neuropharmacology，2001，40（4）:578-589.