灰樹花多糖的分步酶解法提取工藝研究1）

韋朝陽，徐財泉，茆廣華，葉長文，吳應淼，李衛旗＊

（1.浙江大學生命科學學院，杭州 310058；2.浙江方格藥業有限公司；3.浙江慶元縣食用菌科學技術研究中心）

灰樹花（Grifolafrondosa）屬擔子菌亞門、多孔菌科、樹花屬。又名、栗子蘑、蓮花菌、千佛菌、云蕈。日本稱舞茸、葉狀奇果菌。是食、藥用菌。灰樹花子實體具有獨特的芳香味，口味鮮美，富含多種維生素、礦物質與生物活性物質，是近年來我國和日本正在推廣的一種珍貴食、藥兼用真菌[1]。自1984年 Ohno等[2]報道了灰樹花多糖具有抗腫瘤活性以來，對灰樹花多糖的化學結構及保健功能的研究已逐步展開，其對人體良好的生理功能調節作用也逐漸被人們認識。大量的藥理分析與臨床實驗證實，灰樹花多糖具有明顯的抗腫瘤、改善免疫系統功能、抗HIV病毒、調節血糖、血脂及膽固醇水平，對防止癌細胞的生成和轉移、高血壓、肥胖癥、糖尿病、艾滋病及免疫系統功能的紊亂都有一定的療效。特別是其抗腫瘤活性，日本醫學專家用灰樹花多糖進行抗腫瘤實驗結果表明，灰樹花多糖的抑瘤率可達86.2%，比國際公認的抗癌新藥香菇多糖抑制率高32%[3]。對灰樹花多糖的分離提取，傳統的方法是對子實體熱水浸提后再用乙醇沉淀。

由于灰樹花中含有大量的纖維素﹑果膠﹑蛋白質等非多糖類大分子物質，形成了較為致密的子實體結構，大大阻礙了多糖在浸提過程中的釋放。進而人們使用含纖維素酶﹑果膠酶﹑蛋白酶等生物酶類組合的復合酶制劑對灰樹花子實體進行處理，以降解非多糖類物質，使細胞內外的多糖更有效地被提取出來[4]。由于不同的酶類達到最高酶活力所需的酶解溫度和酶解時間等條件各不相同，一次性地使用復合酶制劑對多糖提取效果的改善仍不理想。因此，本文在優化各單一酶的作用條件下，將灰樹花子實體干粉依次采用纖維素酶﹑果膠酶﹑蛋白酶分步處理，使每種酶的活力得到充分發揮，從而最大程度地提高灰樹花多糖提取率和純度。

1 材料與方法

1.1 材料

灰樹花子實體（去柄），由浙江方格藥業有限公司提供。

1.2 試劑

纖維素酶，上海伯奧生物試劑廠；木瓜蛋白酶，四川攀枝花市酶制劑廠；果膠酶，Fluka公司產品；其它試劑均為國產分析純試劑。

1.3 灰樹花多糖的熱水浸提

取100g灰樹花子實體干燥粉碎后，加入2000mL蒸餾水90℃下浸提4h，真空抽濾后濾液濃縮至原體積的1／10，向濃縮液中加入其4倍體積的95%乙醇，攪拌后靜止12h，3000rpm離心10min，去除上清液，沉淀用無水乙醇和丙酮交替潤洗兩次60℃烘干后得灰樹花粗多糖，稱重。

1.4 灰樹花多糖的酶法提取

取100g灰樹花子實體干燥粉碎后，加入2000mL蒸餾水，常溫浸泡2h，調整pH值和溫度至設定值，加入設定量的酶制劑，按設定時間進行酶解，真空抽濾后濾液濃縮至原體積的1／10，向濃縮液中加入4倍體積95%乙醇，攪拌后靜止12h，3000rpm離心10min，去除上清液，沉淀用無水乙醇和丙酮交替潤洗兩次，60℃烘干后得灰樹花粗多糖，稱重。

1.5 灰樹花多糖的分步酶解法提取

首先采用纖維素酶﹑果膠酶﹑木瓜蛋白酶分別單獨對灰樹花子實體樣本進行酶解提取多糖，計算各自的多糖提取率，獲得各種酶的最佳工藝參數。然后在各種酶的最佳工藝條件下，依次采用三種酶對同一灰樹花子實體樣本進行分步處理，最終計算多糖的提取率，并與熱水浸提法及單一酶法提取灰樹花粗多糖提取率的結果進行對照。本實驗對三種酶的四個工藝條件因素設定如下：因素A（相對灰樹花原料的加酶量，%），因素B（酶解溫度，℃），因素 C（酶解pH值），因素D（酶解時間，h）。參照各種酶產品說明書提供的酶活條件范圍，各因素設置三個水平，采用四因素三水平的L9（34）正交表設計因素水平表，以多糖的提取率為指標，通過極差分析，確定各種酶的最佳工藝組合。

1.6 多糖提取率公式

多糖提取率＝（粗多糖質量／灰樹花粗粉質量）×100%

1.7 多糖的純化與光譜分析

灰樹花多糖的純化采用Sevag法[5－6]；樣品水溶液在200～400nm區間722型光柵分光光度計掃描進行紫外光譜分析；紅外光譜分析采用Specerd IP紅外光譜儀，KBr壓片。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶提取灰樹花多糖的工藝條件優化

表1 纖維素酶正交試驗因素水平表

表2 纖維素酶提取灰樹花多糖的正交試驗結果

對纖維素酶設定的工藝因素水平見表1。以多糖提取率為指標進行正交試驗，結果見表2。由正交試驗表的極差分析看出，其中各因素對提取率的影響順序依次為：d加酶量＞b初始pH值＞c加熱溫度＞a加熱時間。由直觀分析得到最佳纖維素酶提取工藝組合為Ea1b3c1d3，即當加熱時間為60min，初始pH值調至4.5，加熱溫度40℃，加酶量為1.5%。實驗證明，在此條件下，灰樹花多糖提取率可達23.41%。

2.2 果膠酶提取灰樹花多糖的工藝條件優化

表3 果膠酶正交試驗因素水平表

表4 果膠酶提取灰樹花多糖的正交實驗結果

由正交試驗表的極差分析看出，其中各因素對提取率的影響順序依次為：c加熱溫度＞d加酶量＞b初始pH值＞a加熱時間。由直觀分析得到最佳果膠酶提取工藝組合為Ea3b2c2d3，即當加熱時間為180min，初始pH值調至4，加熱溫度60℃，加酶量為1.5%。實驗證明，在此條件下，灰樹花多糖提取率可達24.53%。

2.3 木瓜蛋白酶提取灰樹花多糖的工藝條件優化

對木瓜蛋白酶設定的工藝因素水平見表5，以多糖提取率為指標進行正交試驗，正交試驗結果分析見表6。

表5 木瓜蛋白酶正交試驗因素水平表

表6 木瓜蛋白酶法提取多糖的正交實驗結果

表6結果表明，對木瓜蛋白酶而言，因素A（加熱時間）的極差值最大，對多糖的提取率影響最大，因素D（加酶量）影響最小。由直觀分析得到最佳果膠酶提取工藝組合為Ea3b1c2d2，即當加熱時間為180min，初始pH值調至5，加熱溫度60℃，加酶量為1.0%。實驗證明，在此條件下，灰樹花多糖提取率可達25.78%。

2.4 分步酶解法提取的粗多糖提取率對比試驗

圖1 多種提取方法的多糖提取率比較

采用以上3種酶的最佳工藝條件依次對同一批灰樹花子實體樣品進行處理后，并與熱水浸提法及單一酶法提取灰樹花粗多糖提取率的結果進行對照，結果如圖1。由圖1可知，相對熱水浸提法，3種單一酶提取灰樹花子實體多糖都不同程度地提高了多糖的提取率。采用3種酶依次對同一批灰樹花子實體樣本進行分步處理后（即分步酶解法提取多糖），粗多糖提取率有了顯著提高。對照熱水浸提法的多糖提取率為20.38%，依次采用纖維素酶﹑果膠酶﹑木瓜蛋白酶分步酶解法提取灰樹花多糖的提取率達28.62%，提高了40.4%。由此可見在對灰樹花子實體中的纖維素、果膠及游離蛋白等非多糖類大分子進行充分酶解后，細胞內外的多糖成分獲得了有效的釋放。

2.5 灰樹花多糖的紫外光譜分析

將熱水浸提的粗多糖和分步酶法提取獲得的粗多糖各進行5次Sevag法去蛋白萃取處理后，獲得提純后的灰樹花多糖樣品1和樣品2，作紫外光譜分析，結果如圖2、圖3。由圖2、圖3可見，樣品1在280nm波長處仍有明顯吸收峰，說明由熱水浸提法提取的粗多糖中由于結合蛋白較為牢固，經Sevag法去蛋白處理后仍不能完全去除。而樣品2在280nm波長處已沒有吸收峰，說明由分步酶解提取法提取的粗多糖中的結合蛋白在經Sevag法去蛋白處理后即能較完全地去除，多糖純度得以提高[7]。

圖2 樣品1的紫外光譜

圖3 樣品2的紫外光譜

2.6 灰樹花多糖的紅外光譜分析

將提純后的灰樹花多糖樣品2再進行紅外光譜測試，圖4為其紅外圖譜。圖4中的峰很好地反映了灰樹花多糖的β－葡聚糖的特性。3422cm－1出現一寬峰表示有O-H的伸縮振動，2927cm－1的弱吸收是C-H的特征峰，1634cm－1是C＝O的伸縮振動造成的1389cm－1的峰是 C-H 的變角振動，1250cm－1～950 cm－1的這組強吸收峰是吡喃糖環的醚鍵（C-O-C）和羥基的吸收峰。化合物分子在紅外光譜圖譜上的每一個吸收峰，都對應于分子中原子或官能團的振動情況。不同的分子具有一系列不同的吸收峰。多糖化合物在紅外光譜圖中具有一些特征峰，利用這些特征峰就能夠確定多糖的一些基本結構。以上紅外光譜的基本信息與作為吡喃型β－葡聚糖的灰樹花多糖的一些基本結構的信息是完全符合的。

3 討論

本實驗結果表明，利用纖維素酶﹑果膠酶﹑木瓜蛋白酶在各自的最佳酶解條件下分步處理灰樹花子實體后，多糖能有效地得到釋放，灰樹花粗多糖的提取率可達28.62%，比傳統的熱水浸提法要提高40.4%，灰樹花多糖提取率得到大幅提高，從而為灰樹花多糖的高效提取提供了一種新的工藝。通過紫外光譜掃描分析表明，經分步酶解法提取灰樹花多糖中的蛋白含量遠低于熱水浸提法提取的灰樹花多糖，多糖純度明顯提高。通過紅外光譜檢測結果顯示，經分步酶解法提取的灰樹花多糖含有吡喃型β－葡聚糖的結構，與常規提取方法所得的灰樹花多糖具有一致的結構特征。

[1]李小定，榮建華，吳謀成.灰樹花多糖藥理研究進展[J].天然產物研究與開發，2003，15（4）：364-369.

[2]Ohno N，Suzuke I，Oikawa S，et al.Effect of glucans on the antitumor activity of Grifolan[J].Chemical and pharmaceutical Bulletin，1986，34（5）：2149-2151.

[3]邊衫，葉波平，奚濤，等.灰樹花多糖的研究進展[J].藥物生物技術，2004，11（1）：60-63.

[4]Ohno N，Adachi Y，Suzuki L，et al.Characterization of the antitumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa[J].Chemical and pharmaceutical bulletin，1986 ，34（4）：1709-1715.

[5]張惟杰.糖類復合物生化研究技術[M].杭州：浙江大學出版社，1994：87-95.

[6]陳石良，孫震，谷文英，等.灰樹花深層發酵菌絲體多糖的酶法提取及其抗腫瘤作用[J].無錫輕工業學報，2000 ，19（4）：732-738.

[7]劉紅梅，李棟，樊夢丹，等.灰樹花多糖的復合酶－微波提取、超濾純化及生物學評價[J].中成藥，2011，33（4）：594-560.