野桑蠶絲膠1基因Ser1A′及其上游調控序列的克隆和序列分析*

黃 科 伍 杰 陳典剛 張永紅 李春峰 周澤揚，3

(1.西南大學蠶學與系統生物學研究所，生物技術學院，重慶 400716;2.重慶文理學院花卉研究所，重慶 402160;3.重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331)

蠶絲蛋白主要由絲素和絲膠組成。絲膠蛋白在中部絲腺特異表達，主要由絲膠1蛋白和絲膠2蛋白組成[1-2]。家蠶絲膠1蛋白由4條不同的mRNA編碼，由同一條mRNA經不同的剪切方式形成，其長度分別為10.5kb、9.0kb、4.0kb和2.8kb[3]。1997年Garel A等比較系統地闡明了家蠶4.0kb絲膠1基因的mRNA序列，在家蠶基因組中絲膠1基因含8個內含子[4]。絲膠2基因也通過不同的剪切方式形成兩條mRNA編碼絲膠2蛋白[2]。絲膠1蛋白和絲膠2蛋白的表達受到組織的嚴格調控，也受到幼蟲發育時期的調控[5]?；蜣D錄調控中，啟動子是關鍵，啟動子序列所含的順式作用元件與轉錄調控因子的結合決定基因的轉錄。家蠶絲膠1基因啟動子中存在三個順式作用元件SA(-103～-85)、SB(-149～-135)和SC(-204～-183)，都能特異的與轉錄因子(SGF-1，SGF-3)結合[6]。絲腺轉錄因子1(SGF-1)屬于head/HNF-3家族，能特異結合SA位點，認為決定了絲膠1基因的組織特異性表達[7]。體外轉錄實驗表明去除SA元件能下調絲膠1基因啟動子的活性[6]。絲腺轉錄因子3(SGF-3)在絲腺核抽提物中含量最多，能與SC位點特異的結合，體外轉錄實驗同樣證明去除SC位點絲膠1基因啟動子的活性也存在下調[8]。

我們在克隆家蠶絲膠1基因上游調控序列構建中部絲腺特異表達轉基因載體時，發現不同家蠶品系絲膠1基因上游調控序列存在差異，在調查的66個家蠶品系中，絲膠1基因上游調控序列的-1015～+48位置存在多態性，PCR擴增結果有1063bp、636bp及同時出現這兩種條帶的情況[9]。家蠶(Bombyx mori)是由野桑蠶(Bombyx mandarina)馴化而來，二者的親緣關系很近。家蠶經歷了強烈的人工選擇，成為了完全馴養的昆蟲，并依賴人類而生存，而野桑蠶完全在自然條件下生存。與家蠶相比，野桑蠶具有較強的疾病防御及抗逆能力，但其蠶繭大小、生長速率等經濟性狀則顯著弱于家蠶。本實驗調查了不同地方的野桑蠶絲膠1基因上游調控序列，結果表明野桑蠶 sericin1上游調控序列也存在多態性，分別為636bp(HQ702378)及1061bp(HQ702379)。對野桑蠶絲膠1基因(HQ702380)編碼序列進行克隆，通過序列比對，分析家蠶與野桑蠶絲膠1基因同源序列之間的差異，旨在為進一步了解絲膠1基因的表達調控有所幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野桑蠶材料來自山東、重慶青木關、四川瀘州、資陽、南充、湖南、蘇州和日本。克隆用宿主菌DH5α、質粒pSLfa1180fa由本實驗室保存。DNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶購自PROMEGA 公司 ;限制性內切酶 Hind III、Eco RI、Mlu I、Sal I和 Sma I及 pMD18-T-vector購于TaKaRa公司;膠回收試劑盒購于上海華舜公司。

1.2 野桑蠶絲膠1基因的克隆

以GenBank中登錄的家蠶絲膠1基因(sericin 1A)的核酸序列(AB112019.1)設計引物，Ser1 F:5'ATGCGT TTCGT TCTGTGCTGC 3'，Ser1 R:5'T TAGT TGTATTAAACACCGAT 3'，擴增野桑蠶絲膠1基因。參照T ripure試劑說明提取重慶青木關野桑蠶5齡第3天絲腺總RNA，然后以野桑蠶總RNA為模板，按M-MLV反轉錄酶的使用說明進行cDNA第一鏈的合成。以野桑蠶cDNA為模板，用引物對Ser1 F/Ser1 R進行PCR擴增，反應條件為:94 ℃預變性4 min;94℃30 s，55℃40 s，72 ℃4 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的產物，克隆到pMD18-T-vector中，酶切鑒定后送交上海英俊公司進行測序。

1.3 野桑蠶絲膠1基因上游調控序列的克隆

根據GenBank中登錄的家蠶絲膠1基因上游調控序列(AB007831.1)和家蠶絲膠1基因mRNA序列(AB112019.1)設計引物，上游引物為 Ser1p F:5'AAAGCATAAGCGGTCAGAAACC 3'，下游引物 Ser1p R:5'GGTCTT TGGATCGCTTGATCC 3'，通過PCR擴增野桑蠶絲膠1基因上游調控序列。野桑蠶基因組DNA的抽提采用蛋白酶K/RNA酶A的方法提取。以抽提的野桑蠶基因組DNA為模板，用引物對Ser1p F/Ser1p R進行PCR擴增，反應條件為:94℃預變性4min;94℃50 s，60℃55 s，72℃90 s，35個循環;72℃延伸 10min。將PCR產物回收、克隆、酶切鑒定并測序。

1.4 序列分析

克隆的野桑蠶絲膠1基因序列用DNAStar軟件預測其蛋白質序列與家蠶Sericin 1 A′(Ser 1A′，BAD00699.1)，sericin 1A(Ser 1A ，BAD00698.1)，sericin 1B(Ser 1B ，BAD00700.1)，sericin 1B(ser 1B，Q17240)作muscle序列分析。將測定的野桑蠶絲膠1基因上游調控序列和家蠶品系J115 Sericin 1上游調控序列及GenBank中登錄的Sericin 1上游調控序列AB007831.1作muscle序列分析。

2 結果

2.1 野桑蠶絲膠1基因的克隆

以5齡3天野桑蠶絲腺cDNA為模板，用引物對Ser1 F/Ser1 R擴增得到一條約2.1 kb的條帶。將該片段回收連接到pMD18-T載體中，用Hind III和EcoRI雙酶切鑒定篩選的重組質粒，酶切出一條長度約2.1 kb的片段(圖1)。陽性克隆進行測序后，由于野桑蠶絲膠1基因重復序列較多，導致不能拼接出完整的ORF序列。針對此種情況，先將克隆的野桑蠶絲膠1基因酶切，形成較小的片段后進行亞克隆，亞克隆測序后再進行拼接。將克隆的野桑蠶絲膠1基因用多種限制性內切酶分別進行酶切，結果發現Mlu I可以將克隆的野桑蠶絲膠1基因酶切成約700 bp和1.4 kb的兩個片段。利用pMD18-T vector上Sal I和Sma I酶切位點，將克隆的野桑蠶絲膠1基因同時以 Mlu I、Sal I和Sma I進行酶切，回收700 bp小片段亞克隆到pSLfa1180fa載體的Mlu I、Sal I位點，回收1.4 kb大片段亞克隆到pSLfa1180fa載體的Mlu I、Sma I位點。將兩個亞克隆經酶切鑒定(圖2)及測序拼接，得到一條完整的ORF序列(GenBank登錄序列號:HQ702380)。

圖1 野桑蠶絲膠1基因的PCR及重組質粒的酶切檢測

圖2 亞克隆酶切鑒定

2.2 野桑蠶絲膠1基因上游調控序列克隆

以8個不同地方野桑蠶基因組DNA為模板，用引物對Ser1p F/Ser1p R進行野桑蠶絲膠1基因上游調控序列PCR擴增，從山東野桑蠶基因組DNA中擴增出一條約1kb條帶，從湖南野桑蠶、四川南充野桑蠶和重慶青木關野桑蠶基因組DNA中擴增出一條約600bp條帶，另外4個樣品沒有擴增結果(圖3)。將擴增出約600bp條帶的青木關野桑蠶及擴增出1kb條帶的山東野桑蠶的PCR產物回收后，克隆到pMD18-T載體。重組質粒經過酶切驗證后進行測序。

圖3 野桑蠶Sericin1啟動子PCR擴增

2.3 野桑蠶絲膠1基因序列分析

克隆的野桑蠶Sericin 1序列用DNAStar預測其蛋白質序列與家蠶Sericin 1A′(Ser1 A′，BAD00699.1)、Sericin 1A(Ser1 A ，BAD00698.1)、Sericin 1B作 muscle序列分析(圖4)，結果表明:預測的野桑蠶絲膠1蛋白與家蠶Sericin 1 A′、Sericin 1A、Sericin 1B(Ser 1B，BAD00700.1)、Sericin 1B(ser 1B，Q17240)有較強的相似性，相似性分別為 98%、98%、92%、97%。據Garel等預測的絲膠1蛋白(Ser 1B，Q17240)一級結構中，Ser 1B多肽中含1、2、3、4、5、7、8、9外顯子[4]，而野桑蠶絲膠 1蛋白與家蠶Ser1 A′相似性最高，其只含1、2、7、8、9外顯子，因此將克隆的2176bp野桑蠶絲膠1基因命名為B.mandarin Sericin1 A′。野桑蠶絲膠蛋白中存在由38個氨基酸組成的重復序列，包含約40%的絲氨酸(圖5)，正是由于這些重復序列導致測序后拼接非常困難，利用內切酶切成小片段亞克隆后才完成拼接。

2.4 野桑蠶絲膠1基因上游調控序列分析

將克隆的野桑蠶Sericin 1上游調控序列與我們之前克隆的家蠶J115品系Sericin 1上游調控序列，及GenBank中登錄的Sericin 1上游調控序列AB007831.1作muscle序列分析，結果表明克隆的山東野桑蠶Sericin 1上游調控序列、青木關野桑蠶Sericin 1上游調控序列片段和家蠶Sericin 1上游調控序列具有很強的相似性。1061bp絲膠1基因上游調控序列是636bp絲膠1基因上游調控序列中插入約400bp的片段，而前后約300bp是一致的，克隆的野桑蠶絲膠1基因上游調控序列中也存在SA、SB和SC基序(圖6)?？寺〉囊吧ＰQ絲膠1基因上游調控序列在GenBank中登錄序列號分別為HQ702380和HQ702379。

圖4 預測的野桑蠶絲膠1蛋白序列與家蠶絲膠1蛋白序列比對

圖5 野桑蠶絲膠1蛋白序列的重復基序

圖6 野桑蠶Sericin 1上游調控序列與家蠶Sericin 1上游調控序列比對分析

3 討論

家蠶絲膠1基因在基因組中是單拷貝的，轉錄后通過不同的剪切方式形成4條mRNA，其長度分別為10.5kb、9.0kb、4.0kb和2.8kb[3]。Garel等指出在家蠶絲膠1基因剪切時1、2、7、8和9外顯子存在于所有形式的mRNA中，而3、4、5和6外顯子是選擇性剪切的，所有外顯子都包含的絲膠1基因mRNA命名為Ser1C，不包含3和4外顯子的絲膠1基因mRNA命名為Ser1D;不包含外顯子6的絲膠1基因mRNA命名為Ser1B;不包含外顯子3和6的絲膠1基因mRNA命名為Ser1A;不包含外顯子3、4、5和6的絲膠 1基因mRNA命名為Ser1A′[4]。而本實驗克隆的重慶野桑蠶絲膠1基因編碼序列與家蠶Ser1A′相似性非常高，其僅包含絲膠1基因的1、2、7、8和9外顯子，故將其命名為野桑蠶Ser1A′。野桑蠶Ser1A′富含絲膠1基因的特征性重復基序，正是由于重復基序的存在，完整的野桑蠶Ser1A′編碼序列在測序時形成特殊的結構而造成測序困難，而將野桑蠶Ser1A′編碼序列酶切為較小的兩個片段后，分別克隆到pSLfa1180載體然后進行測序，由于序列重復度減小，兩個亞克隆測序后經拼接得到完整的Ser1A′編碼序列。

在調查不同地方野桑蠶絲膠1基因上游調控序列多態性時，發現與家蠶相似，也存在1061bp與636bp兩種PCR擴增情況，但沒有發現在同一個地方個體中同時存在636bp和1061bp的情況，而這種情形在家蠶中也是存在的[9]，這可能與我們調查的同一個地方樣品數量少有關。除此之外，野桑蠶絲膠1基因上游調控序列與家蠶絲膠1基因上游調控序列間存在極強的相似性，絲膠基因表達調控的三個順式作用元件都位于相應的位點。

家蠶由野桑蠶馴化而來，目前對家蠶絲膠基因的研究比較多，而對野桑蠶絲膠1基因的研究報道較少，本研究在家蠶絲膠1基因研究基礎上，僅克隆了野桑蠶絲膠1基因Ser1A′，而野桑蠶中的絲膠1基因其它不同剪切方式則有待研究。

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