唾液生長激素釋放肽在腮腺、頜下腺、舌下腺中的表達(dá)

馬 穎

自1999年唾液生長激素釋放肽(Ghrelin)被發(fā)現(xiàn)以來[1］，許多研究表明Ghrelin主要由胃黏膜X/A樣細(xì)胞分泌，其次來源于腸道、胰、腎、胎盤、垂體及下丘腦。而最新的研究顯示，在人的唾液中也有Ghrelin的表達(dá)[2］，但是唾液 Ghrelin的來源尚不明了。唾液腺組織中是否有Ghrelin存在尚有待了解。本研究擬采用免疫組織化學(xué)的方法檢測Ghrelin在腮腺、頜下腺、舌下腺中的表達(dá)，探討唾液腺與唾液Ghrelin表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 兔抗人Ghrelin抗體(美國Phoenix公司)，3%過氧化氫，正常羊血清封閉液(北京中山公司)，DAB顯色液(北京中山公司)，蘇木精稀釋液，二抗原液(辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔Ig抗體，北京中山公司)。

1.2 標(biāo)本制取 選擇口腔頜面部惡性腫瘤患者頸部檢查淋巴結(jié)陰性、行選擇性頸清掃、病理證實(shí)為正常的頜下腺標(biāo)本7例，腮腺標(biāo)本3例，以及口底腫物擴(kuò)大切除時(shí)舌下腺標(biāo)本3例，切取部分腺體組織作為檢測腺體Ghrelin表達(dá)的標(biāo)本。

1.3 免疫組織化學(xué)方法 (1)石蠟切片脫蠟至水，將切片放于60℃燒烤箱烘烤20 min以防止掉片。取出后馬上放入二甲苯中進(jìn)行脫蠟。二甲苯10 min，無水乙醇和95%、85%、80%、70%乙醇各5 min，水洗5 min。(2)3%H2O2室溫孵育 5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。(3)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。(4)正常山羊血清封閉，室溫孵育20 min，去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2 h或4℃過夜。(5)PBS沖洗3次，3 min/次。(6)滴加適當(dāng)比例稀釋的二抗，室溫孵育20 min。(7)PBS沖洗3次，3 min/次。(8)DAB顯色。(9)蘇木精復(fù)染，清水沖洗5～10 min。(10)脫水透明，封片。(11)用圖像分析儀進(jìn)行細(xì)胞學(xué)定位，觀察Ghrelin在唾液腺中的表達(dá)。

2 結(jié)果

在腮腺、頜下腺及舌下腺染色的標(biāo)本切片中，可以明顯觀察到腺體部分區(qū)域顯示深棕色顆粒(圖1～3)。正常腮腺的切片中可見Ghrelin在紋管細(xì)胞漿呈強(qiáng)陽性表達(dá)，漿液性腺胞胞漿有少量表達(dá)，見圖1。頜下腺的切片中可見:Ghrelin在紋管細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，漿液性腺細(xì)胞漿少量表達(dá)，黏液性腺胞胞漿陰性表達(dá)，見圖2。舌下腺的切片中可見Ghrelin紋狀管和閏管細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，黏液性腺細(xì)胞胞漿呈陰性表達(dá)，見圖3。陽性顯色主要位于導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿，且紋管和閏管細(xì)胞的胞漿均可觀察到Ghrelin陽性表達(dá)，漿液性腺胞細(xì)胞的胞漿中有少量存在陽性表達(dá)，而黏液性腺胞胞漿則無Ghrelin的表達(dá)。上述3大腺體均有Ghrelin陽性表達(dá)，不同部位未見明顯差異。

圖1 Ghrelin在正常腮腺中的表達(dá)(DAB×200)

3 討論

Ghrelin主要由胃黏膜X/A樣細(xì)胞分泌，其次來源于腸道、胰、腎、胎盤、垂體及下丘腦等部位。在胃腸道中，胃底部的Ghrelin含量最高，其次為十二指腸和回腸，結(jié)腸最低。血漿和組織中的Ghrelin含量不同，正常人血漿中Ghrelin的濃度100～120 pmol/L，胃和小腸中的濃度為腎的140倍，內(nèi)腎組織中的濃度又高于血漿濃度數(shù)倍[3－4］，提示這些組織可能通過自分泌和旁分泌在局部發(fā)揮作用。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法，觀察到在正常唾液腺組織中均有Ghrelin表達(dá)，主要分布部位在導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿，漿液性腺胞胞漿也有微弱表達(dá)，而黏液性腺胞無表達(dá)。

唾液腺組織不僅是外分泌器官，也具有內(nèi)分泌功能。己知唾液腺合成分泌入血的肽類物質(zhì)達(dá)30種以上，常見的激素樣物質(zhì)或調(diào)節(jié)肽有表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、腮腺激素、高血糖素、胃泌素、緊張素、促紅細(xì)胞生成素、心房肽(心鈉素)、大活動(dòng)蛋白、S-100蛋白、神經(jīng)元特異丙烯醇化酶、抑生長素、突觸泡蛋白、降鈣素等。本研究結(jié)果提示，唾液腺組織可以合成、分泌Ghrelin，唾液腺是除腸道、胰、胃、腎、胎盤、垂體及下丘腦等部位以外的又一個(gè)Ghrelin分泌器官，唾液中的Ghrelin可能來自唾液腺的組織。

雖然多數(shù)內(nèi)分泌多肽可由不同的唾液腺合成、存儲(chǔ)、分泌，但絕大多數(shù)分泌入血的肽類是由頜下腺合成分泌，舌下腺也有類似的功能。只有少數(shù)動(dòng)物的腮腺導(dǎo)管系統(tǒng)中可見到某些肽類，如豬的腮腺可合成高血糖素和胃泌素，而狗的腮腺可合成胃泌素。本研究中，腮腺、頜下腺及舌下腺均有明顯的Ghrelin表達(dá)，其間無明顯差異，說明這3大唾液腺均可合成和分泌Ghrelin。

唾液腺內(nèi)分泌物質(zhì)的合成幾乎全部在導(dǎo)管系統(tǒng)。導(dǎo)管系統(tǒng)的顆粒導(dǎo)管細(xì)胞及紋管細(xì)胞是合成并儲(chǔ)存這些多肽物質(zhì)的主要場所。人類唾液腺內(nèi)沒有顆粒導(dǎo)管系統(tǒng)，因而內(nèi)分泌物質(zhì)可能會(huì)存在于紋管細(xì)胞內(nèi)。本研究結(jié)果顯示，Ghrelin在紋管及閏管細(xì)胞均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，提示人體唾液腺組織合成和分泌Ghrelin的主要部位在紋管細(xì)胞和閏管細(xì)胞。

Ghrelin分泌機(jī)制尚不清楚。唾液腺組織中Ghrelin的表達(dá)與唾液中Ghrelin的濃度有何關(guān)系，以及進(jìn)食前后唾液腺組織中的Ghrelin表達(dá)是否有差異尚待進(jìn)一步研究。

[1] Date Y，KojimaM，Hosoda H，etal.Ghrelin，a novelgrowth hormone-releasin G acylated peptide，is synthesized in a distinctendocrine cell type in the gastrointestinal tractsof ratsand humans[J］.Endocrinology，2000，141:4255－4261.

[2] Teber F，Grau M，Mena MP，etal.Epidermal growth factor secreted from submandibular salivary glands interfereswith the lipolytic effect of adrenaline in mice[J］.Endocrinology，2000，141:876－882.

[3] Rindi G，Necchi V，Savio A，et al.Characterrisation of gastric Ghrelin cells inman and othermammals:syudies in adultand fetal tissues[J］.Histochem Cell Biol，2002，117:511 －519.

[4] Matsumoto M，Hosoda H，Kitajima Y，etal.Structureactivity relationship ofGhrelin:pharmacological study ofGhrelin peptides[J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，287:142－146.