豬HEV實驗感染SD大鼠的研究*

王曉娟,常義賓,王 玲,耿家寶,卜秋寧,付紅偉,朱永紅

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis Evirus,HEV)感染引起的急性肝炎,但在器官移植病人中也有慢性化的報道[1],主要經糞口途徑傳播,也有經輸血[2]和母嬰垂直傳播[3]的報道。HEV感染的特點是主要侵犯青壯年,兒童和老年人群多為亞臨床感染,孕婦感染后病死率可高達20%[4]。根據核酸序列分析可將HEV分為四個主要基因型,1、2、3、4型。目前認為基因 1型和 2型只能感染人,而3型和4型既可感染人,也可感染多種動物。在自然界中已發現了多種HEV動物宿主,并且有報道人食用感染HEV動物的肉制品后患戊型肝炎的病例,并經測序證實,病人感染的HEV與從肉制品中分離到的HEV的基因同源性為100%[5],證實了HEV在人和動物之間的傳播。因此,戊型肝炎已被公認為是一種人獸共患病,并相繼有研究報道了HEV在不同動物間的跨種系傳播[6],提示多種動物在HEV的傳播方面可能起重要作用。

近年來研究顯示,除了非人類靈長類、豬和雞外 ,在狗 、貓 、牛 、羊 、馬 、嚙齒類動物 、貓鼬 、鹿 、家兔等其他動物物種中也檢測出抗-HEV抗體。其中,嚙齒類動物抗-HEV抗體檢出率較高,但各地報道結果不盡相同,而且通過實驗室感染嚙齒類動物的研究結果顯示,嚙齒類動物是否對HEV易感尚無統一定論。因此,為進一步探討嚙齒類動物對HEV的易感性,本實驗用豬HEV分別經尾靜脈注射和經口途徑對SD大鼠進行了實驗感染,現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 動物來源及分組 22只健康SD大鼠,體重180 g左右,均購自北京大學醫學部實驗動物中心,分籠喂養。大鼠的飼養和使用按照《北京市實驗動物管理條例》(2004年修訂)進行。實驗前已通過實驗動物倫理審查。22只實驗大鼠隨機分為四組:第一組6只經尾靜脈注射0.6×102GE HEV病毒懸液(病毒滴度為102GE/m l);第二組6只經尾靜脈注射1.2×102GE HEV病毒懸液;第三組5只經灌胃途徑給予0.6×102GE HEV病毒懸液,第四組5只經灌胃途徑給予1.2×102GE HEV病毒懸液,每組均設1只對照,經相應途徑給予相應劑量的10%PBS懸液。

1.2 病毒來源及接種 取HEV 4型豬糞便標本(本實驗室曾用此株病毒株成功感染上獼猴[7])用PBS(pH 7.4)制成10%(m/v)糞便懸液,4℃4 000 r/min離心30min,取上清,用0.45μm 和0.22μm的濾器過濾上清,-80℃貯存備用。分別將兩份10%的豬糞便懸液進行10倍梯度稀釋,采用基因組當量法(Genom ic Equivalent,GE)進行病毒定量,作為本實驗的病毒懸液感染動物。該糞便懸液的病毒滴度為102GE/m L。實驗動物的分組及感染劑量見表1。

表1 實驗動物分組及HEV感染的各項觀測結果Tab le 1 Results of each group with different doses of HEV administration

1.3 標本收集及檢測 所有動物在感染前及感染后每隔3d分別收集糞便和血清標本,直到感染后60d為止。大鼠血清用EIA法檢測抗-HEV抗體;并對所有的血清標本用日立全自動生化分析儀7170A(日本日立高新技術貿易有限公司)檢測血清A LT。當A LT有明顯升高時,處死大鼠,取其肝臟,分別用10%甲醛和4%多聚甲醛固定,做石蠟切片和透射電鏡切片,做病理學檢測。

1.4 HEV RNA提取及檢測 總RNA提取試劑盒和AMV反轉錄酶購自Promega公司,Taq-plus DNA聚合酶和引物合成來自上海生物工程技術服務有限公司。取糞便上清120μL或血清標本100 μL,按總RNA提取試劑盒說明書操作提取HEV RNA,逆轉錄后采用巢式PCR進行擴增。

引物系參照中國豬HEV 4型序列(GenBank accession num ber:AY594199)設計。兩套引物(P引物和S引物,涵蓋HEV基因1-4型)均為本實驗室常用的擴HEV RNA的通用引物,且已證實均能成功地從人和豬的血清及糞便標本中擴增出HEV RNA[8-9]。引物序列詳見表2。

RNA模板35μL,10×PCR緩沖液5μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,P1、P4或 S1、S4各 3 μL,AMV反轉錄酶0.2 u,42℃反轉錄50 min,加入2.5 u的 Taqplus DNA聚合酶,然后進入第1輪PCR:94℃5 min,94℃1 min,50℃1 min,72℃1min,30個循環,72℃延伸8min;第2輪PCR引物為P2、P3或S2、S3各3μL,加5μL第一輪產物,總體積為50μL:94℃5 min,94℃45 S,50℃45 S,72℃45 S,30個循環,72℃延伸8 min。每次均設陰陽性對照。

表2 HEV RNA ORF1和OFR2部分核苷酸序列RT-nPCR擴增引物Table2 Sequences of primers for HEV RT-nPCR

2 結 果

2.1 ALT水平及臨床體征 在大劑量病毒(1.2×102GE)靜脈注射組有4只大鼠在感染后2周左右血清A LT水平出現了較明顯的升高,并伴有精神不振、腹瀉、毛發無光等癥狀,其它組的大鼠ALT水平雖有波動但與感染前的大鼠A LT平均值相比無明顯差異。

2.2 抗-HEV抗體及HEV RNA 在整個實驗過程中,僅有1只經尾靜脈注射1.2×102GE HEV糞便懸液的SD大鼠(簡稱Y鼠)在實驗觀察期內出現了抗-HEV抗體陽轉(4只ALT水平輕微升高的SD大鼠有1只突然不明原因死亡,2只在ALT水平升高時處死取肝臟做病理,因而這3只大鼠的血清抗-HEV抗體OD值缺失),其他組的大鼠均未檢測到HEV抗體。所有大鼠血清和糞便標本均用HEV P引物和S引物檢測,但均未檢測到 HEV RNA,只有Y鼠的糞便核酸擴增出現過陽性,但測序失敗。

2.3 肝組織病理學 取A LT值上升的大鼠肝組織做病理檢查,在光鏡下可見肝組織出現輕微炎癥性病理學改變:血竇內皮可見散在單核細胞和淋巴細胞粘附,匯管區及纖維間隔中有散在淋巴細胞和少量單核細胞浸潤(見圖 1)。電鏡未見病毒樣顆粒。

3 討 論

本室曾用與本研究所用相同的豬HEV 4型病毒株成功地感染了獼猴。感染后獼猴出現糞便排毒和病毒血癥,HEV抗體陽轉,ALT水平異常升高,肝活檢顯示典型的急性病毒性肝炎病理學改變,電鏡下可見肝細胞中散在大量戊型肝炎病毒樣顆粒。以上研究結果證明該株豬HEV病毒能夠在實驗條件下引起跨物種(豬HEV感染獼猴)感染。因此,本研究選用了相同的病毒株來探討其對嚙齒類動物感染的可能性。

圖1 SD大鼠肝組織病理學改變(H.E.染色)A為HEV感染鼠的肝組織切片;B為對照鼠的肝組織切片。放大倍數:20×Fig.1 Pathologic changes in livers of SD rats(Hematoxy lin and eosin stain)A:Liver section from HEV in fected SD rat,B:Liver section from normal SD rat magnification:20×ob jective

盡管獼猴經大劑量注射HEV病毒懸液后出現ALT水平明顯升高并持續3周,但在本實驗中僅有4只經尾靜脈注射1.2×102GE的同一株病毒懸液的SD大鼠在感染后2周左右出現了ALT水平的升高,其他組大鼠A LT水平的平均值和注射后對照組大鼠的ALT水平相比差異不顯著。這種結果可能是由于豬HEV對SD大鼠的致病性較弱,所導致的肝組織病變較輕微,不足以導致明顯的ALT水平變化,只有較大劑量的病毒感染才會出現明顯的改變。Maneerat[10]等曾報道W istar大鼠在感染HEV后ALT基本為正常水平;Fen Huang[11]等也報道用豬HEV感染BALB/c裸鼠中也發現ALT無明顯變化。因此,對于不同鼠種來說,ALT能否作為反映各種嚙齒類動物肝臟輕微病變的有用指標或者敏感性指標仍需進一步研究證明。取ALT值升高較明顯的大鼠肝組織做病理學檢查,光鏡下可見肝組織出現輕微的炎癥性病理改變,提示可能由豬HEV感染所致。

血清學檢測中經尾靜脈注射 1.2×102GE HEV病毒懸液的4只SD大鼠之一Y鼠在感染后第40 d出現了抗-HEV抗體陽轉(因4只ALT水平升高的SD大鼠有1只突然不明原因死亡,2只在A LT水平升高時處死取肝臟做病理,因而這3只大鼠的血清抗-HEV抗體OD值缺失),并伴有A LT水平輕微升高、精神不振、腹瀉等癥狀。此外,Y鼠的糞便核酸擴增出現過陽性,雖然測序失敗,但以上結果均提示感染成功。測序失敗的原因可能是豬HEV在SD大鼠體內復制率較低,病毒在血液及糞便中的濃度均較低且持續時間較短,所以病毒核酸不易被擴出。以往對嚙齒類動物的血清抗-HEV抗體檢測發現,HEV感染很普遍且HEV抗體陽性率較高,但在抗HEV陽性鼠標本中均未擴增出HEV核酸序列,提示嚙齒類動物雖在HEV傳播中可能起重要作用,但鼠與人之間的HEV感染關系尚不清楚,鼠是否為HEV自然宿主尚待深入研究。本實驗結果雖然提示豬HEV 4型可能會跨種系傳播感染SD大鼠但易感性較低,且需較大的感染劑量,但由于病毒核酸擴增測序失敗,因此,SD大鼠是否對豬HEV易感尚有待進一步研究證實。

[1]Kamar N,Selves J,Mansuy JM,et al.Hepatitis Evirus and chronic hepatitis in organ-transplant recipien ts[J].N Engl J Med,2008,358(8):811-817.

[2]Mitsui T,Tsukamoto Y,Yamazaki C,etal.Prevalence of hepatitis Evirus infection among hemodialysis patients in Japan:Evidence for infection with a genotype 3 HEV by blood transfusion[J].JMed V irol,2004,74(4):563-572.

[3]Khuroo MS,Kamili S,Khuroo MS.Clinical course and duration of viremia in vertically transmitted hepatitis Evirus(HEV)infection in babies born to HEV-in fected mothers[J].J Viral Hepat,2009,16(7):519-523.

[4]Skidmore S.Overview of Hepatitis E V irus[J].Cu rr Infect Dis Rep,2002,4(2):118-123.

[5]Takahashi K,K itajima N,Abe N,et al.Complete o r near complete nucleotide sequences of hepatitis Evirus genome recovered from a wild boar,adeer,and four patientsw ho ate the deer[J].V irology,2004,330(2):501-505.

[6]Meng XJ.Hepatitis Evirus:animal reservoirs and zoonotic risk[J].Vet Microbiol,2010,140(3-4):256-265.

[7]Ji YL,Zhu YH,Liang JR,et al.Sw ine hepatitis Evirus in rural sou thern China:genetic characterization and experimental in fection in rhesusmonkeys(MacacamμLatta)[J].JGastroen terol,2008,43(7):565-570.

[8]Fu HW,Li LJ,Zhu YH,et al.Hepatitis Evirus infection among animals and humans in Xin jiang,China:Possibility of swine to human transmission of spo radic Hepatitis E in an endemic area[J].Am JT rop Med Hyg,2010,82(5):961-966.

[9]Chang YB,Wang L,Geng JB,et al.Zoonotic risk of hepatitis Evirus(HEV):A study of HEV infection in animals and humans in subu rbs of Beijing[J].Hepatol Res,2009,39(12):1153-1158.

[10]Maneerat Y,C layson ET,Myint KS,et al.Experimental infection of the laboratory rat with the hepatitis Evirus[J].J Med Virol,1996,48(2):121-128.

[11]Huang F,ZhangW,Gong G,et al.Experimen tal infection of BA LB/cnudemice with Hepatitis Evirus[J].BMC Infectious Diseases,2009,93:1471-2334.