利用血細胞計數板檢測牛凍精活精子百分率和活力的效果分析

陳 軍，韓 東，鄧 強

(新疆畜牧總站，烏魯木齊 830009)

利用血細胞計數板檢測牛凍精活精子百分率和活力的效果分析

陳 軍，韓 東，鄧 強

(新疆畜牧總站，烏魯木齊 830009)

使用血細胞計數板對牛細管凍精的活精子百分率和活力進行了檢測。結果表明：在檢測活精子百分率時，血細胞計數板與臺盼蘭染色兩者差異不顯著（P＞0.05）；解凍后1 h、 2 h和3 h，用計數板方法連續檢測解凍后精子活力，檢測數據重復性較好。使用血細胞計數板直接檢測凍精的活精子百分率和活力方便有效。

凍精 ；活精子百分率 ；活力；血細胞計數板

凍精品質分析是判斷種公牛繁殖力和凍存效果的有效手段[1]。精子的活力、活精子百分率、頂體完整率和畸形率與受胎率的關系密切。Woelders等[2]分析了牛和豬凍精和鮮精受胎率后指出，活精子百分率和頂體形態指標可作為判斷受胎率的指標。Januskauskas等[3]研究發現，牛冷凍精液解凍后的鏡檢活率與穿卵精子數及56天不返情率呈極顯著的正相關。

分析凍精質量時，由于受實驗條件的限制，尤其在人工授精現場分析時，大部分都采用目測評估。該法簡單快捷易于操作，但經驗性較強，不易掌握，分析結果因人而異變化較大，對奶牛場生產安排和經濟效益產生一定的影響。而血細胞計數板法作為一種最為可靠和最為經典的計數技術，重復性好、準確率高、方法簡便，它不僅適用于血細胞計數，還可用于其他動物細胞在顯微鏡下計數。本實驗探討采用血細胞計數板觀察凍精的活力和活精子百分率，并就這種方法的檢測結果與常規方法進行了比較。

1 材料與方法

1.1 凍精

西安德瑞良種奶牛推廣中心制。

1.2 器材

血細胞計數板(簡稱血球板)：QIU JING制造(02270113號)，倒置顯微鏡：Nikon TS100。

1.3 精液稀釋液

配制參見[4]。

1.4 精液解凍

將細管凍精置于37℃溫水中30 s內解凍，立即用38.5℃的TAPL液稀釋3倍，置于38.5℃的CO2培養箱，供后續檢測分析。

1.5 精子密度測定

取干凈的計數板平放于實驗桌上，用少量水浸濕平行小溝的外沿，然后放上干凈的蓋玻片。吸取少量待測精液用超純水稀釋10倍，用移液槍取10 μl稀釋后的精液樣，拭凈槍頭，將槍頭輕輕置于蓋玻片邊緣，讓精液懸心平穩地緩慢流出，通過毛細管作用進入計數室內。準備一大的培養皿,下墊一塊浸濕的濾紙，將計數板放入其中，蓋上蓋子，靜止5 min。小心取出計數板，放于顯微鏡載物臺上靜止2～3 min, 待精子不再浮動后便可計數。先在低倍鏡下找到計數室的中央大方格，然后在高倍鏡(40×物鏡)下計數，求出每毫升精液中精子的密度。

1.6 精子活力測定

目測評估(簡稱估測)：為便于在顯微鏡下計數，用移液槍取10 μl待測精液，滴在載玻片，加上蓋玻片，置于顯微鏡下放大250～400倍檢查，計數一個視野下直線前進運動精子與非直線運動精子的比例，求出活力；血細胞計數板計數(簡稱血球板計數)：吸取待測精子用TAPL液再次稀釋(稀釋倍數以便于觀察計數為易)，用移液槍取10 μl TAPL液稀釋后的精子樣，讓精液通過毛細管作用進入計數室內，統計出4個角及中央共5個中方格中的非直線運動的(包括死精子、擺動、旋轉運動)的精子數，求出每毫升精液中非直線運動的精子數。每份精液在解凍后0 h、1 h、2 h和3 h分別計數精子活力，且每個時間段分別用2種方法重復計數5次，求其均值。

1.7 精子存活率

臺盼蘭染色法：100 μl待測精子加10 μl 0.4 g/L臺盼蘭溶液，38.5℃、CO2培養箱孵育3～5 min后制板，自然干燥，顯微鏡下觀察200個精子?；罹硬恢谰映始t色或藍色。血細胞計數板計數法：操作同精子活力檢測，統計出4個角及中央共5個中方格中的死精子數，求出每毫升精液中死精子數。每份精液解凍后立即檢測，分別用兩種方法重復計數5次，求其均值。

1.8 統計分析

配對比較總體均數進行t檢驗。

2 結果

2.1 兩種方法計數精子存活率的比較

從表1可知，兩種分析方法之間差異不顯著(P＞0.05)。血球板變異系數(CV)與臺盼蘭染色計數法的變異系數相近，重復性也較好。

表1 兩種方法計數精子活率的比較

2.2 3個時間段精子活力的分析

由表2統計分析表明，3個時間段凍精活力的檢測數據隨著時間的延長變異系數逐漸增大，組內重復性好。

表2 3個時間段精子活力的分析

3 討論

在1852年就有人開始設計對紅細胞的計數辦法，1855年發明了用于計數血細胞的計數板。目前仍然使用的改良Neubauer計數板就是應用最為廣泛和持續時間最為長久的一種。雖然各種類型的血細胞計數儀已在廣泛使用，但血細胞計數板法仍然是最為可靠和最為經典的計數技術。血細胞計數板用于精子計數目的，主要是在制作凍精和體外受精時測定精子的密度，而不用于活精子百分率或精子活力的測定?？赡苁怯捎谟嫈蛋宓挠嫈党厣?.1 mm，活精子和死精子不處于同一焦平面上，往往造成計數結果誤差。本實驗以TAPL液為稀釋液，用血細胞板計數法分析凍精品質，取得了較好的檢測效果。從表1和表2可知，凍精活率檢測與臺盼蘭染色法無顯著差異，而且凍精活力檢測數據重復性好，說明用血細胞計數板法檢測精子活力和活精子百分率是可行的。

為了便于觀測和保持精子活力，本試驗采用了較為復雜的TAPL液，而在實際的應運中用滅菌生理鹽水，即可保證檢測分析進行。由表2數據說明，經3個時間段對解凍后精子活力進行連續檢測，隨著存放時間的延長監測數據變異系數逐漸增大?？赡苁请S時間的延長，精子活力下降，出現扎堆現象，造成計數結果不準確。所以，解凍后盡快進行精子常規檢測，以保證分析結果的準確性。而3個時間段血細胞計數板法重復性好，準確性高，方法簡便，不失為一種提高牛精液常規檢查質量，客觀反映精液情況的好方法。

[1] 董偉.家畜繁殖學[M].北京：中國農業出版社，1999, 144.

[2] Waelders H. Fundamentals and recent development in cryopreservation of bull and boar semen[J].Vet Q, 1997, 19: 135-138.

[3] Januskauskas A, Johannisson A, Rodriguez-Martine H. Assessment of sperm quality through fluorometry and sperm chromatin structure assay in relation to field fertility of frozen-thawed semen from sedish AI bulls[J]. Theriogenology,2001, 55:947-961.

[4] Nolan JP, Graham JK, Hammerstedt RH. Artificial induction of exocytosis in bull sperm. Arch Biochem Biophys 1992, 292:311-322.

S823.3

A

1005-2739（2011）06-0015-02

2011-09-26

陳軍(1978-)，男，碩士，畜牧師。

E-mail：junchen08@163.com