牛跟腱制造海綿狀膠原蛋白纖維的技術研究

王秋卓

隨著生物工程技術的迅猛發展和重大突破，生物材料己成為各國學者競相進行研究和開發的熱點。其中膠原止血海綿因具有可吸收性、良好的生物相容性、較低的免疫原性、較好的穩定性和機械強度等優點而受到普遍青睞[1]。20 世紀 80年代，即已在美國和歐洲廣泛上市并應用于臨床，并取得了很好的臨床效果，目前廣泛應用于神經外科手術止血、肝脾臟創傷止血、腎臟手術止血、胃潰瘍岀血、牙科手術止血、泌尿外科手術止血及皮膚創傷等多個領域[2]。但目前膠原止血材料大多因生產成本較高或純度較差等缺點，止血效果不夠理想，遠遠無法滿足實際臨床需要。

為此，我們以牛跟腱為原材料，針對膠原止血材料均勻度、抗原性、色澤以及纖維細度等性狀，在現有技術的基礎上，進一步深入研究了可吸收性膠原止血海綿的關鍵生產步驟并進行改造，并觀察了產品的純度和膠原纖維結構。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮牛跟腱；常規試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 膠原蛋白纖維的制備[3-5]

1.2.1.1 預處理 將新鮮牛跟腱洗凈，置于超凈工作臺上的潔凈不銹鋼盤中，剔除黏膜、脂肪等附著組織，75%乙醇除菌、除脂后，–20℃速凍保存。取速凍后牛跟腱，用切片機切成 1mm 薄片，稱取 10 g 牛跟腱，加入 200 ml去離子水，4℃恒溫條件下用切碎機打碎、勻漿，每次勻漿時間為30min，直至組織懸浮不見組織碎片為止，置于冰柜 4℃冷卻。

1.2.1.2 提純酶化 在冷卻后的組織懸浮溶液中分別加入 5 mol/L NaCl 溶液 50 ml、HAc 溶液 7.5 ml，以及10 mg/ml 胃蛋白酶溶液 2.5 ml，調整 NaCl、HAc、胃蛋白酶的最終濃度分別為1 mol/L、0.5 mol/L、0.1 mg/ml，4℃消化 48 h，以利用胃蛋白酶消化去除非膠原蛋白和膠原蛋白的非螺旋部分。

1.2.1.3 成纖維 將提純酶化后樣品 3000×g離心30min，去除上清液（包括蛋白多肽和其他組織細胞成分）。在沉淀中加入 300 ml 去離子水，勻漿，以 1 mol/L NaOH調節溶液的 pH 值為7.0 左右，4℃放置過夜。3000×g離心 30min，去除上清液（包括微量的殘留胃蛋白酶和DNA）。在沉淀中加入 10mmol/L HCl 溶液 300 ml，搖蕩后 4℃放置過夜。勻漿，加入 1/10 體積的 0.2 mol/L Na2HPO4調節溶液的 pH 值為7.2，4℃放置過夜。3000×g離心 30min，去除上清液，以去離子水洗滌沉淀后，加入 200 ml 去離子水，充分勻漿，置于模具中，–50℃速凍，然后在冷凍干燥機中凍干 28 h，凍干曲線為–45～–5℃20 h、–5～0℃4 h、0～20℃4 h，20℃保溫 4 h。

實驗均在符合 GMP 標準的實驗室中進行，環境潔凈度控制在 1 萬級，操作溫度在 4～8℃范圍內。

1.2.2 膠原蛋白纖維純度分析 采用 SDS-PAGE 法。將1 mg 樣品溶于 5 ml SDS-PAGE 樣品溶液，95℃水浴振蕩加熱 5min。以 I 型膠原標準品作為對照，上樣，4%凝膠和 8%分離膠分離后，考馬斯亮藍染色。

1.2.3 膠原蛋白纖維結構分析 利用透射電鏡和衍射實驗，觀察膠原纖維的完整性。電鏡下可見一定周期性橫紋的紋路是鑒定膠原纖維的決定性依據。

將樣品用 PBS 稀釋至終濃度為0.1 mg/ml，并充分振蕩使之分散成單纖維，然后轉至電鏡載網（碳化鍍膜）上，放置 10min。在水中漂洗 2～3 次，加醋酸鈾染色 5～10min，在水中漂洗 5～10min，置于電鏡下觀察。

2 結果

2.1 外觀性狀

圖1 膠原蛋白纖維 SDS-PAGE 分析

制備的樣品潔白、疏松、均勻，類似于去脂棉性狀的膠原蛋白纖維，根據模具不同可制成海綿狀或片狀等不同形狀。

2.2 膠原蛋白纖維純度分析

SDS-PAGE 電泳分析結果顯示，在 I 型膠原標準品電泳帶相對應處可見單一、清晰的膠原蛋白纖維條帶，樣品純度較高（圖1）。

2.3 膠原蛋白纖維結構分析

電鏡下觀察膠原蛋白纖維結構，可見膠原纖維特有的一定周期性橫紋紋路，結構完整（圖2）。

圖2 膠原蛋白纖維結構的電鏡觀察（×200 000）

3 討論

本技術在現有膠原蛋白纖維生產技術的基礎上加以改造，克服了酶化學法提純重組膠原分子生產工藝復雜、成本高、膠原纖維穩定性和機械強度較差的缺點，同時也克服了化學法制備膠原纖維的純度較差且無法去除膠原分子的非螺旋部分，導致免疫原性較強的不足[6-8]。在北京、成都、內蒙等地進行的重復性實驗表明，本技術具有良好的重復性和再現性，制造的產品也比較理想。

我們利用天然膠原蛋白纖維良好的止血功能及可靠的纖維機械強度，利用胃蛋白酶消化，有效去除了非膠原蛋白和膠原蛋白的非螺旋結構 C 末端和 N 末端，從而消除了材料原有的抗原性；在此基礎上，對樣品又進行了兩步純化，進一步去除了蛋白多肽、其他組織細胞以及殘留的胃蛋白酶[9-10]。經過特殊工藝進行結構修飾后，實驗結果表明所得的膠原蛋白纖維材料具有低抗原性，以及良好的生物相容性、穩定性和機械強度，是一種理想的止血生物材料。

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