左旋精氨酸通過上調Th1應答介導抗瘧保護性免疫

潘艷艷，劉 軍，李 瑩，延 娟，馮永輝，王各各，馮 輝，鄭 麗，曹雅明

(中國醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，遼寧沈陽 110001)

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的嚴重威脅人類生命的感染性疾病之一。最新的統計顯示，全世界每年有2～3億瘧疾感染病例，病死人數高達100萬［1］。

L-Arg能夠發揮抗腫瘤、促進傷口愈合和增強機體細胞免疫和體液免疫應答等多種功能［2－3］。尤其是L-Arg的免疫增強作用已備受關注。有限的研究表明瘧疾感染患者L-Arg水平明顯降低［4］，L-Arg能夠恢復印度尼西亞患有嚴重瘧疾的成人內皮功能以及促進NO的產生［5］。IFN-γ直接或間接抑制瘧原蟲肝內期的發育是L-Arg依賴的［6］。然而，目前關于L-Arg在瘧疾感染免疫中對Th1免疫應答的作用尚不清楚。

本研究利用我們成功建立的P.y17XL易感鼠瘧模型，觀察了L-Arg對P.y17XL易感鼠的Th1免疫應答影響，以期探討L-Arg在P.y17XL感染中的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、瘧原蟲及主要試劑6～8周齡、♀BALB/c小鼠由中國醫學科學院實驗動物研究所提供(許可證編號:SCXK京200420001);P.y17XL(日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈);抗體均購自BD或eBioscience公司;L-Arg購自 Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。

1.2實驗動物感染BALB/c小鼠分別經腹腔感染1×106P.y17XL寄生的紅細胞(pRBC)，感染不同時間小鼠經尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數紅細胞感染率，并每日觀察生存率。

1.3動物分組與L-Arg處理BALB/c小鼠隨機分為2組:生理鹽水處理組(NC組)、感染前7天LArg處理組(L-Arg組)。每組20只小鼠。1.5 g·kg－1體質量口服生理鹽水或L-Arg。

1.4脾細胞培養小鼠感染0、3和5 d無菌摘取脾臟，常規制備脾細胞懸液，以臺盼藍液檢查脾細胞活性，確定活細胞超過90%。用含10%FCS的RPMI1640調整脾細胞終濃度至每毫升1×107個，24孔培養板(FALCON)，每孔加入500 μl細胞懸液，1式3孔，培養48 h。350×g室溫離心10 min，收集上清，－80℃保存，待測細胞因子及NO。

1.5細胞因子及NO檢測雙抗體夾心ELISA法對小鼠脾細胞培養上清IFN-γ的含量分別進行檢測，酶標儀(Inter MedNJ-2100)測定450 nm處OD值。繪制標準曲線，計算細胞因子含量(ng·g－1)。Griess試劑檢測脾細胞培養上清中NO含量，100 μl細胞培養上清液和100 μl Griess反應液室溫反應10 min，酶標儀檢測550 nm處OD值，以NaNO2作為標準品進行濃度換算。

1.6流式細胞儀檢測小鼠脾臟CD4+CD69+T細胞、F4/80+CD36+巨噬細胞。每份樣品用抗－CD4-FITC單抗和抗－CD69-PE單抗進行雙色分析。脾細胞懸液中加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體，再加入抗－F4/80－FITC單抗和抗－CD36－PE單抗進行表面染色。離心去上清后，用0.5 ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。

1.7統計學分析使用SPSS統計軟件對數據進行處理，采用獨立樣本t檢驗對數據做統計分析。

2 結果

2.1小鼠感染不同時間原蟲血癥及其生存率如Fig 1所示，NC組小鼠感染后3 d原蟲血癥水平開始迅速上升，小鼠于感染后d 6～8全部死亡。與此相比，L-Arg組小鼠原蟲血癥上升緩慢，在感染d 16小鼠全部死亡。

2.2小鼠感染不同時間CD4+CD69+T細胞和F4/80+CD36+巨噬細胞數量如Fig 2所示，與NC組相比，L-Arg組小鼠于感染后 d 3和 d 5 CD4+CD69+T細胞和F4/80+CD36+巨噬細胞數量均出現升高(P＜0.05)。

2.3小鼠感染不同時間脾細胞培養上清中IFN-γ和NO水平如Fig 3所示，L-Arg組小鼠于感染后d 3和d 5 IFN-γ和NO水平均比NC組小鼠高(P＜0.05)。

3 討論

在紅內期保護性免疫應答中，CD4+T細胞發揮至關重要的作用，瘧原蟲感染早期宿主建立的以IFN-γ分泌增加為主的Th1型細胞免疫應答是抑制紅內期瘧原蟲增殖的關鍵效應機制［7］。我們發現，L-Arg明顯促進了Th1免疫應答的建立，原蟲血癥水平得到控制、生存期延長。同時，我們還發現LArg組小鼠F4/80+CD36+細胞數量出現有意義的升高。CD36是清道夫受體家族B型受體，目前認為CD36在介導巨噬細胞非調理性吞噬功能中發揮重要作用［8］。研究表明CD36缺陷個體發生嚴重瘧疾的危險性要明顯升高［9］。巨噬細胞是非特異性免疫效應分子NO的重要來源，NO氧化后形成的過氧化氮是巨噬細胞發揮殺傷毒性的主要效應分子［10］，我們發現脾細胞培養上清中NO產生也出現明顯升高。

Fig 1 The parasitemia(A)and survival rate(B)in different time after infection

Fig 2 Absolute numbers of CD4+CD69+cells(A)and F4/80+CD36+cells(B)in splenocytes in different time after infection

Fig 3 Level of in IFN-γ(A)and NO(B)in splenocyte supernatants in different time after infection

綜上，L-Arg能夠有效地增強易感的BALB/c小鼠感染早期Th1型細胞免疫應答的建立，對于研制抗瘧新藥將具有重要的科學意義。

［1］WHO:World Malaria Report 2010［R］.http://www.who.int/malaria/world_malaria_report_2010/en/index.html.

［2］Barbul A，Lazalou S A，Efron D T，et al.Arginine enhances wound healing and lymphocyteimmune responsesin humans［J］.Surgery，1990，108(2):331 －7.

［3］楊 濤，張 偉，張 雷.L-精氨酸-NO途徑抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心?。跩］.中國藥理學通報，2008，26(10):1361－5.

［3］Yang T，Zhang W，Zhang L.L-Arginine-NO pathway inhibits the hypertrophic response of cultured cardiomyocytes induced by angiotensin Ⅱ［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，26(10):1361 －5.

［4］Dowling D P，Ilies M，Olszewski K L，et al.Crystal structure of arginase from Plasmodium falciparum and implications forL-Arginine depletion in malarial infection［J］.Biochemistry，2010，49(26):5600－8.

［5］Yeo T W，Lampah D A，Gitawati R，et al.Recovery of endothelial function in severe falciparum malaria:relationship with improvement in plasmaL-Arginine and blood lactate concentrations［J］.J Infect Dis，2008，198(4):602 －8.

［6］Nüssler A，Drapier J C，Rénia L，et al.L-Arginine-dependent destruction of intrahepatic malaria parasites in response to tumor necrosis factor and/or interleukin 6 stimulation［J］.Eur J Immunol，1991，21(1):227－230.

［7］Yazdani S S，Mukherjee P，Chauhan V S，et al.Immune responses to asexual blood-stages of malaria parasites［J］.Curr Mol Med，2006，6(2):187－203.

［8］Berry A，Chene G，Benoit-Vical F，et al.Ex vivo andin vitroimpairment of CD36+expression and tumor necrosis factor-alpha production in human monocytes in response to Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes［J］.J Parasitol，2005，91(2):316 －22.

［9］Aitman T J，Cooper L D，Norsworthy P J，et al.Malaria susceptibility and CD36+mutation［J］.Nature，2000，405(6790):1015－6.

［10］Fritsche G，Larcher C，Schennach H，et al.Regulatory interactions between iron and nitric oxide metabolism for immune defense against plasmodium falciparum infection［J］.Infect Dis，2001，183(9):1388－94.