人類胚胎干細胞分化研究

劉 超，劉麗華，方圣云

(安徽醫科大學1.基礎醫學院組胚教研室，2.臨床藥理研究所，安徽合肥 230032;3.馬里蘭大學生物醫學工程和技術中心，Baltimore，MD 21201 USA)

胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)具有自我更新(self-renewal)和多能性(pluripotent)的特點。人類胚胎干細胞(human embryonic stem cell，HESC)研究既有助于對人類疾病和發育生物學的理解，也在再生醫學和新藥研發和評價中有著廣泛的應用前景［1－2］。HESC分化成人體任何一種細胞的能力為人類發育研究和重大疾病替代治療提供了取之不盡的細胞來源。首先，來源于HESC的神經祖細胞為人類神經形成研究，中樞神經系統發育研究和帕金森病以及脊髓損傷等疾病的細胞替代治療帶來巨大希望。但是目前常用的HESC神經系分化方法仍然存在較多不足，例如形成 embryoid bodies(EBs)中間體的方法存在非神經細胞系的污染，限制了神經系分化的效率和特異性;使用基質細胞(PA6或MS5)共培養方法和使用Matrigel，存在動物類材料和病原體的污染［3］。因此，發展可控條件下的無EB中間體形成、無滋養層細胞、無動物成分的高效HESC培養和神經分化方法成為再生醫學研究中亟待解決的問題。其次，HESC的分化特性，使其成為一種發育研究的細胞來源，為發育生物學研究提供良好的研究平臺。為此，我們在無滋養層細胞培養基礎上，建立一種使用無動物成分細胞基質和化學成分已知培養液誘導HESC神經系分化方法;我們還研究視黃酸誘導H9細胞分化過程中內質網應激相關蛋白BIP表達的變化，探索H9細胞分化在發育研究中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1H9細胞HESC，H9 細胞系(P23 ～)，購自美國國家干細胞銀行(WiCell，Madison，WI)。

1.1.2試劑mTeSRTM1購自加拿大 Stem Cell公司。Matrigel購自美國BD Bioscience公司。視黃酸(All-trans retinoic acid，RA)、二甲亞砜(DMSO)、human insulin、progesterone、putrescin、human fibronectin、sodium selenite、human holotransferrin、recombinant人Ⅳ型膠原、polyornithine和human laminin購自美國Sigma公司。Pierce ECL免疫印記化學發光試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。bFGF購自美國Cell Signaling公司。B27 supplement購自美國Invitrogen公司。Human Vitronectin購自美國 Promega公司。DMEM:F-12購自美國Cellgro公司。

1.1.3抗體anti-Oct4和 anti-BIP抗體購自 Cell Signaling，anti-β-actin抗體購自 Sigma，anti-Map2 和anti-Tuj1抗體購自Chemicon。

1.2 方法

1.2.1H9細胞培養參考公司手冊和文獻方法［4］，H9細胞培養在Matrigel包被的培養板內，給以mTeSRTM1培養液。每天換液1次，細胞生長4～6 d后，除去分化的細胞，按1∶6的比例進行傳代。1.2.2神經分化參考文獻方法［5］，選擇有穹頂樣隆起結構的H9細胞群，行機械分離轉移到人源基質(10 mg·cm－2Ⅳ型膠原、0.2 mg·cm－2vitronectin和5 mg·cm－2fibronectin)包被的培養皿內，給予mTeSRTM1培養液。1周后將形成的花樣結構(rosette-like structure)轉移到新包被的培養皿內或玻片上，給與神經分化培養液(DMEM:F-12，B27 supplement，25 g·L－1human insulin，6.3 mg·L－1progesterone，10 g·L－1putrescin，50 μg·L－1sodium selenite，50 g·L－1human holotransferrin 和8 μg·L－1human recombinant bFGF)。培養7 d后，將細胞轉移到polyornithine和laminin包被的培養皿內或玻片上，用神經分化培養液繼續培養4周或4周以上。

1.2.3視黃酸誘導分化用含有10 μmol·L－1RA的mTeSRTM1處理細胞，每天換液1次，持續5 d。d 6將H9細胞收獲裂解，裂解液經免疫印記(immunoblot，IB)檢測相關蛋白表達。

1.2.4免疫熒光檢測分化和未分化的H9細胞用4% 多聚甲醛固定，1×PBS清洗6遍，室溫下用含1%BSA和0.1%saponin的1×PBS封閉60 min，一抗同樣用含1%BSA和0.1%saponin的1×PBS稀釋，室溫下和細胞孵育2 h后，用抗兔或抗鼠的Alexa Flour-488以及Alexa Flour-594抗體室溫孵育2 h，或用結合有FITC的雞熒光第二抗體孵育2 h。封片晾干后，置于 Zeiss Axiovert 200M倒置熒光顯微鏡下觀察成像。

1.2.5免疫印記參考文獻方法［6］，將細胞裂解獲得裂解液，BCA法測定蛋白濃度。吸取等量樣品上樣，經SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜(Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)上。分離后的蛋白成分分別和相應抗體孵育后，用ECL免疫印記化學發光試劑盒檢測。蛋白表達的定量用photoshop軟件處理。

2 結果

2.1H9細胞的特征蛋白Oct4表達未分化的H9細胞在無滋養層細胞培養條件下生長良好，其核內表達特征性蛋白Oct4(Fig 1A，B)，分化后的細胞核內Oct4的表達基本消失(Fig 1C，D)。

2.2神經前體細胞分化H9細胞經神經分化培養液處理后，分化7 d的H9衍生細胞90%表達有神經前體細胞特征性蛋白Nestin(Fig 2A，D，arrows)，一定數量的細胞表達神經元特征蛋白Tuj1(Fig 2B，D，arrow heads)。

2.3神經細胞分化分化21 d的H9衍生細胞形成神經管樣結構(Fig 3 A，C，arrows)，且該類結構周圍存在大量Tuj1陽性細胞(Fig 3B，D)。提示神經管樣結構的形成可能促進H9細胞神經分化。分化46 d的H9衍生細胞同時表達神經細胞特征蛋白Map2(Fig 3E)和Tuj1(Fig 3F)。

2.4RA誘導分化的H9細胞內BIP蛋白表達的變化H9細胞經RA處理5d，Oct4蛋白的表達隨分化逐漸下調，5 d后其表達已幾乎消失(Fig 4A);而BIP蛋白的表達隨分化逐漸上調(Fig 4A，B)。提示BIP可能參與RA誘導的H9細胞分化。

Fig 1 Expression of Oct4 in H9 and H9 derived cells

Fig 2 Neural progenitor cells derived from H9 cells

3 討論

ESC是高度未分化的細胞，具備體外無限增殖和誘導分化成三個胚層細胞的特性。HESC為再生醫學提供了取之不盡的功能性細胞來源，為疾病研究提供新型的細胞模型的同時也為藥物藥效學和毒理學的研究提供了良好的平臺［7－9］。

本研究采用人源基質和化學成分特定的神經分化培養液誘導神經分化。人源基質材料包括Ⅳ型膠原、vitronectin和 fibronectin。其中一定濃度的vitronectin及其衍生肽已經被最新文獻報道可用于胚胎干細胞的長時間培養［10－11］。我們所用神經分化培養液的主要化學成分包括B27 supplement，N2 supplement(主要含 human insulin，progesterone，putrescin，sodium selenite，human holotransferrin)和bFGF。上述成分已經被廣泛用于胚胎干細胞神經分化研究［3］。我們誘導分化的神經細胞經機械分離后可獲得90%以上的Nestin陽性細胞，形成的神經管樣結構富含Tuj1陽性神經元。這類衍生的神經細胞將是神經退行性疾病的細胞替代療法的潛在細胞來源，還可以用作篩選神經系統疾病相關藥物的平臺。

BIP是一主要的內質網分子伴侶，參與內質網蛋白質量控制以及內質網膜信號活化的調控，參與多種生理和病理過程［12］。最近的研究發現［13］，純合子BIP敲除導致小鼠死亡，伴隨胚胎細胞分化能力顯著降低和內細胞層嚴重凋亡，相對的雜合子小鼠則可以成活且其表型正常。在非洲爪蛙的早期發育中，不同時間和空間BIP mRNA的表達呈現不同方式;內質網應激則可以促進BIP mRNA在相應胚胎結構內的表達［14］。文獻報道［15］，BIP 在胚胎發生過程中表達而且RA可以激活胚胎瘤細胞內的BIP啟動子。此外，RA在胚胎發育中扮演重要角色［16］，同時也參與干細胞向神經前體細胞、造血母細胞和心肌細胞等功能性細胞的定向分化［17－20］。因此本研究采用含RA的mTeSRTM1誘導H9細胞分化，以探索HESC在發育研究中的潛在作用。我們發現隨RA誘導分化BIP蛋白表達逐漸升高，一方面驗證了RA對BIP的調節功能，一方面也提示BIP蛋白在發育過程中的潛在作用，為干細胞分化用于發育相關的基礎研究提供了較明確的實驗支持。

Fig 3 Neurons derived from H9 cells

Fig 4 Upregulation of BIP in differentiated H9 cells

綜上所述，HESC的神經分化，使大規模的衍生神經細胞的獲得成為可能，為相關神經疾病的研究和藥物篩選研究提供潛在的細胞來源和平臺。而RA誘導的HESC的分化，可為發育生物學研究提供較好的體外研究平臺。

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