豬產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

底佳芳 郭文飛 徐恩娟 浙江匯能動(dòng)物藥品有限公司，杭州 310012

產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌，在自然界分布極廣，可見(jiàn)于土壤、污水、飼料、食物、糞便以及人畜的腸道等中。該菌為條件性致病菌，在一定條件下，可引起多種嚴(yán)重疾病。雞的壞死性腸炎以及仔豬紅痢都是由產(chǎn)氣莢膜梭菌感染所引起的嚴(yán)重的腸道疾病，該兩病是影響?zhàn)B殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要疾病，它可導(dǎo)致快速生長(zhǎng)的肉雞以及仔豬的死亡。在生產(chǎn)條件下，亞臨床型產(chǎn)氣莢膜梭菌病更為常見(jiàn)，由于動(dòng)物沒(méi)有明顯的臨床癥狀，常常被忽視，但其生長(zhǎng)速度和飼料利用率明顯下降，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)帶來(lái)了飼養(yǎng)管理上的麻煩。因此預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌病的發(fā)生，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)來(lái)講十分重要。據(jù)資料報(bào)道，小劑量的那西肽即可抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)，并對(duì)動(dòng)物有較好的促生長(zhǎng)效果。因此，本試驗(yàn)對(duì)四川地區(qū)的豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株進(jìn)行分離和鑒定，并考察那西肽等藥物對(duì)該菌株的抑制效果，為預(yù)防和治療由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的嚴(yán)重疾病提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料的來(lái)源

2008年12 月，某畜牧科技有限公司南充某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)了以仔豬下痢為主的疾病，3～10齡仔豬的下痢較嚴(yán)重,主要以黃痢為主。10齡后部分仔豬出現(xiàn)白痢，后逐漸恢復(fù)正常。在下痢過(guò)程中，部分體質(zhì)較弱的仔豬和出現(xiàn)水樣腹瀉的仔豬發(fā)生死亡，死亡率在12%左右。將病死仔豬解剖后可以觀察到，主要病變發(fā)生在小腸的空腸段和回腸段，表現(xiàn)為脹氣，腸管內(nèi)充滿酸臭灰黃色的內(nèi)容物，其它臟器無(wú)明顯病變。病料選擇病死仔豬的肝臟。

1.2 培養(yǎng)基

VF厭氧菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，購(gòu)自北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司；

亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂培養(yǎng)基（SPS）；

胰蛋白-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC）；

血液瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；

生化鑒定管，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)藥物（表1）

表1 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的藥物品種

2 試驗(yàn)方法

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)及鑒定

將肝臟病料放入VF培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)，36℃培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)菌液分別接種SPS培養(yǎng)基、TSC培養(yǎng)基、血液培養(yǎng)基中，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，挑取可疑菌落在VF培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。對(duì)VF培養(yǎng)基中的菌液進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察，并進(jìn)行生化鑒定。

2.2 藥敏試驗(yàn)

2.2.1 藥物有效成分的提取

根據(jù)獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的藥物進(jìn)行處理，提取出藥物的有效成分備用。

2.2.2 采用試管稀釋法測(cè)定藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株的最低抑菌濃度（MIC）

將提取出的藥物的有效成分進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋，加入含有產(chǎn)氣夾膜梭菌野毒株的VF厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使各種藥物在試管中的終濃度如表2，含有細(xì)菌和藥物的試管于36℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)肉眼觀察判定細(xì)菌生長(zhǎng)情況。經(jīng)培養(yǎng)后，如試管中的溶液澄清透明，說(shuō)明沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng);如試管中溶液變渾濁，說(shuō)明有細(xì)菌生產(chǎn)。通過(guò)細(xì)菌是否生長(zhǎng)來(lái)判定藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株的MIC。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)

將病料肝臟放入VF培養(yǎng)基中培養(yǎng)后觀察，有大量氣泡產(chǎn)生，將該菌液分別接種到SPS培養(yǎng)基、TSC培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。

結(jié)果表明，細(xì)菌在SPS培養(yǎng)基上（圖1）形成表面光滑、邊緣整齊的黑色菌落，菌落凸起呈圓形（符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)特性）。

細(xì)菌在TSC培養(yǎng)基上（圖2）形成圓形凸起、表面光滑、邊緣整齊的較大的黑色菌落（符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)特性）。

在血液瓊脂培養(yǎng)基上（圖3）可見(jiàn)菌落凸起，呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，呈現(xiàn)淡灰色。菌落周圍有雙層溶血圈，內(nèi)圈透明，外圍淺綠（符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)特性）。

3.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定

挑取SPS培養(yǎng)、TSC培養(yǎng)基上的黑色菌落和血液瓊脂培養(yǎng)上的雙溶血環(huán)菌落，接種到VF培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察，并接種于生化鑒定管中，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4和表3。

從圖4可見(jiàn)，細(xì)菌單個(gè)或成對(duì)存在，為兩端鈍圓、短桿狀、粗大正直的桿菌，革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢。

通過(guò)細(xì)菌在SPS培養(yǎng)基、TSC培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，以及革蘭氏染色鏡檢和生化鑒定結(jié)果可知，該細(xì)菌即為產(chǎn)氣莢膜梭菌。將該菌株命名為ZSTG001。

3.3 不同藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 恩拉霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，后3只試管中的液體混濁，并伴有大量氣泡的產(chǎn)生，第7只試管中雖然沒(méi)有氣體產(chǎn)生，但試管中的溶液也呈現(xiàn)混濁狀，說(shuō)明均有細(xì)菌生長(zhǎng)。其余試管中的溶液澄清透明，說(shuō)明沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。因此本試驗(yàn)中恩拉霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌濃度（MIC）為 0.1μg/ml。

3.3.2 維基尼亞霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可知，前7只試管中的液體均為澄清透明，說(shuō)明沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。后3只試管中的液體呈現(xiàn)混濁狀，并伴有大量的氣泡產(chǎn)生，說(shuō)明試管中有細(xì)菌生長(zhǎng)。因此本試驗(yàn)中維基尼亞霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌濃度（MIC）為 0.5μg/ml。

3.3.3 阿維拉霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。從圖7可知，10只試管僅前2只試管中的溶液澄清透明，沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，其余試管中均有細(xì)菌生長(zhǎng)。因此本試驗(yàn)中阿維拉霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌濃度（MIC）為 10μg/ml。

3.3.4 桿菌肽鋅對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。從圖8可知，前5只試管中的液體均為澄清透明，說(shuō)明沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。后5只試管中的液體呈現(xiàn)混濁狀，并伴有氣泡產(chǎn)生，說(shuō)明試管中有細(xì)菌生長(zhǎng)。因此本試驗(yàn)中桿菌肽鋅對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌濃度（MIC）為 10μg/ml。

3.3.5 喹乙醇對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。從圖9可以看出，前5只試管中的溶液澄清透明，說(shuō)明試管中沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。而后5只試管中的溶液呈現(xiàn)混濁狀，并伴有大量的氣泡產(chǎn)生，說(shuō)明試管中有細(xì)菌生長(zhǎng)。因此本試驗(yàn)中喹乙醇對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌濃度（MIC）為 10μg/ml。

3.3.6 吉他霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10。從圖10可以看出，前5只試管中的溶液澄清透明，說(shuō)明沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。其余試管中的溶液均呈現(xiàn)混濁狀，并伴有氣泡產(chǎn)生，說(shuō)明有細(xì)菌生長(zhǎng)。因此本試驗(yàn)中吉他霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌濃度（MIC）為1μg/ml。

3.3.7 鹽酸林可霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11。從圖11可知，這10只試管中的液體均呈現(xiàn)不同程度的混濁狀，前3只試管中的液體呈現(xiàn)略微混濁，說(shuō)明也有細(xì)菌生長(zhǎng)的跡象。因此本試驗(yàn)中鹽酸林可霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001 的最小抑菌濃度（MIC）大于 200μg/ml。

3.3.8 那西肽對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖12。從圖12可以看出，僅后3只試管中的液體為混濁狀，并伴有氣泡產(chǎn)生，說(shuō)明這3只試管中有細(xì)菌生長(zhǎng)，其余試管中的液體均為澄清透明，沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。因此本試驗(yàn)中那西肽對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的最小抑菌濃度（MIC）為 0.0025μg/ml。

圖5 恩拉霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

圖6 維基尼亞霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

圖8 桿菌肽鋅對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

圖9 喹乙醇對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

圖10 吉他霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

圖11 鹽酸林可霉素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

圖12 那西肽對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株ZSTG001的抑菌效果

3.3.9 藥敏試驗(yàn)結(jié)果小結(jié)

不同藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株ZSTG001的抑菌結(jié)果見(jiàn)表4。

4 結(jié)論

4.1 細(xì)菌的分離鑒定

從肝臟病料中分離的細(xì)菌在SPS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特點(diǎn)為邊緣整齊、光滑凸起的針尖般黑色菌落；在TSC培養(yǎng)基上呈現(xiàn)菌落較大、凸起呈圓形、邊緣整齊的黑色菌落；該細(xì)菌在血液瓊脂培養(yǎng)基上可見(jiàn)菌落凸起，呈淡灰色。菌落周圍有雙溶血圈，內(nèi)圈透明，外圈呈現(xiàn)淺綠色。鏡檢觀察細(xì)菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，單個(gè)或成對(duì)存在，兩端鈍圓、短桿狀的粗大直桿菌。并且該細(xì)菌可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖，不能發(fā)酵木糖、甘露醇和水楊苷，吲哚試驗(yàn)為陰性，H2S、MR和硝酸鹽還原及明膠試驗(yàn)均為陽(yáng)性。通過(guò)上述的細(xì)菌生長(zhǎng)特性及生化試驗(yàn)，可判定分離的細(xì)菌即為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

4.2 不同藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株的抑菌效果

這8種藥物對(duì)該產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株有不同的抑制作用，其中以那西肽的抑菌效果最好，其MIC值為0.0025μg/ml；其次為恩拉霉素、維基尼亞霉素和吉他霉素，他們的 MIC 值分別為 0.1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml；阿維拉霉素、桿菌肽鋅和喹乙醇對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌野毒株的抑制效果相同，MIC值為10μg/ml；而鹽酸林可霉素對(duì)該分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌的野毒株幾乎沒(méi)有抑制作用，其MIC值大于200μg/ml。