雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制

崔艷秋 陸 莉 王曉民

(1.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，北京 101300;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系，北京 100069;3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，教育部神經(jīng)變性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

雷公藤(tripterygium wilfordiihook.f.)又名水莽草、黃藥、黃藤、黃藤木、黃臘藤、菜蟲藥、斷腸草等，為衛(wèi)矛科雷公藤屬多年生藤本植物，是我國的傳統(tǒng)中藥。最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱其為“莽草”，其“味辛溫。主風(fēng)頭癰腫、乳癰、疝瘕，除結(jié)氣疥搔，殺蟲魚。生山谷。”明代李時(shí)珍的《本草綱目》中對(duì)雷公藤也有記載。雷公藤根、莖、花均有毒性，藥用部分為去二層皮的根木質(zhì)部，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、殺蟲止血等功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中雷公藤的應(yīng)用也十分廣泛，藥理及臨床研究證實(shí)，雷公藤具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種活性，臨床上廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、器官移植排斥反應(yīng)等多種免疫異常性疾病的治療。

1 雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物

雷公藤提取物的化學(xué)成分極其復(fù)雜，自1936年首次從雷公藤根部提取到萜類色素雷公藤紅素(tripterine)后，迄今已從雷公藤中提取分離出100余種成分［1］。研究分析表明雷公藤含有二萜、三萜、倍半萜、生物堿等多種有效成分及糖類、有機(jī)酸、衛(wèi)茅醇、色素及無機(jī)鹽等多種化學(xué)物質(zhì)。其中，二萜類化合物為雷公藤的主要活性成分，三萜和生物堿亦具活性。

雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，T10)，又名雷公藤甲素，外觀呈白色針狀結(jié)晶體，是雷公藤中含量最高、活性和毒性最強(qiáng)的原生化合物，也是雷公藤的主要活性成分。T10是小分子脂溶性物質(zhì)，T10相對(duì)分子量為360，分子結(jié)構(gòu)如圖1A。T10是一種具有松香烷骨架的二萜，含有3個(gè)環(huán)氧基團(tuán)和一個(gè)α，β-不飽和五元內(nèi)酯環(huán)，這些基團(tuán)在一定條件下會(huì)發(fā)生反應(yīng)，其中C-12，13環(huán)氧遠(yuǎn)離A，B環(huán)，空間位阻較其他兩個(gè)環(huán)氧基團(tuán)小，在親核離子的進(jìn)攻下容易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)而被修飾［2］。雷公藤氯內(nèi)酯醇(tripchlorolide，T4)是從雷公藤中提取出的一種微量的二萜單體化合物［3］，相對(duì)分子量為397，分子結(jié)構(gòu)如圖1B。Yu D Q等［2］以親核試劑攻擊T10的C-12和13位，再將12位羥基酰化并氯化修飾后亦得到T4。作為T10的衍生物，T4不僅提高了母體化合物的溶解性和免疫抑制活性，也使其毒性大大降低［3］。此外，以T10為先導(dǎo)化合物，將C-5羥化修飾，亦可獲得新化合物——5-羥雷公藤內(nèi)酯醇〔(5R)-5-hydroxytriptolide，又名 LLDT-8〕，該化合物相對(duì)分子量為376.4，分子結(jié)構(gòu)如圖1C。Zhou R等［4］通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LLDT-8也是一個(gè)低毒、高效、具有很強(qiáng)免疫抑制活性的新型雷公藤二萜化合物。Wong K F等［5］對(duì)T10及其衍生物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，結(jié)果顯示 C-14 位的 β-羥基(β-hydroxyl)和 γ-丁內(nèi)酯(γ-butyrolactone)結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用的主要活性基團(tuán)。

圖1 雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of triptolide and its analogues

2 T10及其衍生物的神經(jīng)保護(hù)作用

2.1 帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元漸進(jìn)性的變性死亡，紋狀體內(nèi)DA含量明顯下降，從而表現(xiàn)出以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直和姿勢(shì)步態(tài)異常為主要特征的臨床癥狀［6］。大量在體和離體實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果均表明T10及其衍生物對(duì)PD動(dòng)物及細(xì)胞模型具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用。Zhou H F 等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，T10(5 μg/Kg-1·d)預(yù)處理24 d能夠顯著改善黑質(zhì)區(qū)注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元減少和紋狀體DA含量下降。Gao J P等［8］亦證實(shí)，T10能夠在保護(hù)1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl pyridinium，MPP+)注射于大鼠黑質(zhì)部位所引起DA能神經(jīng)元進(jìn)行性損傷和明顯的行為異常。橫斷內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle，MFB)可直接損傷黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元，引起紋狀體DA能纖維變性損傷;T4能夠顯著改善單側(cè)MFB橫斷引起的大鼠行為異常，抑制黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷和紋狀體DA含量下降［9］。此外，T4還對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)作用于 C57BL/6 小鼠引起的行為改變和黑質(zhì)紋狀體DA系統(tǒng)損傷具有明顯的保護(hù)作用［10］。在離體實(shí)驗(yàn)中，T4能夠促進(jìn)原代培養(yǎng)的中腦神經(jīng)元軸突的生長，對(duì)抗MPP+所致的DA能神經(jīng)元損傷［9］;在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中，T10能夠明顯對(duì)抗LPS所引起的DA攝取減少、TH免疫陽性神經(jīng)元缺失和形態(tài)異常［11］。綜上所述，T10及其衍生物能夠在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中拮抗多種神經(jīng)毒性物質(zhì)對(duì)DA能神經(jīng)元的損傷作用。

2.2 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以進(jìn)行性癡呆為主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其標(biāo)志性的病理改變是多發(fā)于皮層和海馬的β淀粉樣蛋白(β-Amyloid，Aβ)沉積、老年斑(senile plaques，SP)形成、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrilar tangle，NFT)、神經(jīng)元減少以及軸索和突觸異常等。Chen L F等［12］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T4能夠明顯改善海馬內(nèi)注射Aβ1-40引起的阿爾茨海默病大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力下降，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。體外實(shí)驗(yàn)［13］也顯示T10對(duì)Aβ導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。Wu M等［14］將Aβ1-42作用于原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，引起神經(jīng)元大量死亡，而T4能夠增加神經(jīng)元的存活率，減少Aβ1-42引起的神經(jīng)元凋亡。上述結(jié)果提示，T10及其衍生物能夠保護(hù)Aβ引起的神經(jīng)元損傷，并改善動(dòng)物的行為異常。

2.3 多發(fā)性硬化

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)性脫髓鞘疾病，其發(fā)病機(jī)制與CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)有關(guān)，發(fā)病的關(guān)鍵是血腦屏障受到破壞，炎性細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致。MS的病理表現(xiàn)在許多方面與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)有相似之處，因此 EAE是研究人類MS理想的動(dòng)物模型。Fu Y F等［15］的研究發(fā)現(xiàn)LLDT-8可以減少髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白(myelin oligodendroglia glycoprotein，MOG)引起的 EAE發(fā)病，降低EAE嚴(yán)重程度。Kizelsztein P等［16］亦證實(shí)口服 T10可以使小鼠EAE發(fā)病延遲，臨床癥狀減少，復(fù)發(fā)率降低。這些結(jié)果說明，T10及其衍生物能夠?qū)笶AE所致的神經(jīng)損傷。

3 T10及其衍生物的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制

3.1 抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性反應(yīng)因子的釋放

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，正常時(shí)占腦內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的10%左右。在內(nèi)源性或外源性損傷因素的刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活，合成和分泌大量細(xì)胞毒性物質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性損傷和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中扮演重要角色。體外實(shí)驗(yàn)［17-18］顯示，T4可以抑制Aβ1-42或LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放一系列炎性反應(yīng)因子如:TNFα、IL-1β、NO、PGE2等，并下調(diào) iNOS、COX2等酶的表達(dá)。Zhou H F 等［7］和Jiao J等［19-20］在離體和在體實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)T10可以抑制LPS和Aβ1-42引起的小膠質(zhì)細(xì)胞異常活化和炎性反應(yīng)因子 TNFα、IL-1β和 NO生成增多。另有研究［15，21］報(bào)道，T10 和 LLDT-8 均可以通過抑制炎性反應(yīng)因子IL-2和/或IFN-γ釋放來減少EAE的發(fā)病率和嚴(yán)重程度。Ma C G等［21］的研究還發(fā)現(xiàn)T10可以上調(diào)具有抑制炎性反應(yīng)作用的細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)。上述結(jié)果表明，T10及其衍生物可以通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎性反應(yīng)因子的釋放，從而減弱炎性反應(yīng)損傷過程，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3.2 抑制MAPKs和NF-κB信號(hào)通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的一類重要信號(hào)系統(tǒng)，是聯(lián)系細(xì)胞膜受體與細(xì)胞內(nèi)重要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)的酶類。MAPKs通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，如生長發(fā)育、炎性反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)等。目前，在真核細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)有4條MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，p38 MAPK通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SPAK)與ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶1(big MAP kinase 1，BMK1)。它們可被不同的細(xì)胞外信號(hào)激活，從而產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)［22］。在原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，T4可以抑制Aβ引起的JNK磷酸化，從而減少下游炎性反應(yīng)因子的釋放［18］。T10則在LPS活化的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均能抑制JNK的活化，而對(duì)ERK和p38 MAPK通路則沒有影響［23-24］。說明JNK可能是T10及其衍生物抑制炎性反應(yīng)因子的釋放，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要分子靶點(diǎn)。

核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下與抑制性蛋白IκB結(jié)合并以非活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)內(nèi)。抑制狀態(tài)的NF-κB對(duì)環(huán)境的變化比較敏感，可以被多種刺激激活，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)一系列參與免疫、炎性反應(yīng)及凋亡的基因表達(dá)。NF-κB的激活參與AD、PD的病理過程，并在Aβ或LPS介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［24］。大量研究［18，24-28］已證實(shí)雷公藤提取物能夠抑制多種免疫細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等的細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化，或者通過穩(wěn)定 NF-κB/IκBα 復(fù)合物，抑制 IκBα 磷酸化和 NF-κB核轉(zhuǎn)位從而減輕炎性發(fā)應(yīng)［16］。提示轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也是T10及其衍生物發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用和抑制神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。

3.3 抗氧化活性

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除失去平衡，或外源性氧化劑的過量攝入導(dǎo)致自由基在體內(nèi)堆積引起細(xì)胞毒性。過量的自由基進(jìn)攻多不飽和脂肪酸可引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能的改變;損傷蛋白質(zhì)的巰基和氨基使蛋白質(zhì)變性、交聯(lián)，使酶的活性喪失;損傷DNA可導(dǎo)致細(xì)胞突變。氧化應(yīng)激與多種神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)和退行性疾病的發(fā)病及進(jìn)展密切相關(guān)［29］。Pan X D 等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，T4能夠抑制LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基生成增加。He Q H等［30］的研究也證實(shí)，T10能抑制谷氨酸引起的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS生成和線粒體膜電位升高。上述結(jié)果提示，T10及其衍生物具有一定程度的抗氧化活性并與其神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)。

3.4 促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放

腦內(nèi)神經(jīng)元的分化、成熟、存活以及突觸建立都需要神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factor，NTFs)的參與。NTFs及其受體水平的改變可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)組織修復(fù)和再生功能的異常進(jìn)而導(dǎo)致某些神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生。NTFs家族由眾多成員組成，其中與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關(guān)的NTFs主要有:神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)等。Xue B等［31］報(bào)道，T10不影響星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放BDNF和GDNF，但明顯促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞NGF mRNA的表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)和培養(yǎng)上清液的NGF蛋白水平。另有研究［9］顯示，T4以劑量依賴的方式促進(jìn)原代培養(yǎng)的中腦多巴胺能神經(jīng)元BDNF mRNA的表達(dá)，并可放大NGF的神經(jīng)營養(yǎng)作用。這些證據(jù)表明，T10及其衍生物通過調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)和釋放發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3.5 拮抗興奮性神經(jīng)毒性和Ca2+超載

興奮性神經(jīng)毒性是指由谷氨酸等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)引起的以N-甲基-D-天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體為主的興奮性氨基酸受體過度持續(xù)興奮而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的過程。在大多數(shù)病理情況下，NMDA受體過度興奮介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流引起的神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性損傷在興奮性毒性作用中占主導(dǎo)地位。興奮性神經(jīng)毒性參與許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病及進(jìn)展過程，正常狀態(tài)下作為第二信使的Ca2+，在興奮毒性損傷時(shí)，其含量的異常增高導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能代謝的不可逆損傷，促進(jìn)了興奮毒性的發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)研究［13，30］表明，T10能夠顯著降低 Aβ 引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而減輕Aβ對(duì)PC12細(xì)胞的損傷和毒性作用，也能明顯拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。以上的結(jié)果提示T10可通過降低胞內(nèi)Ca2+的濃度、抑制神經(jīng)元鈣超載，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

目前，大量研究已經(jīng)證實(shí)T10及其衍生物具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，具體機(jī)制涉及抗炎和免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)營養(yǎng)等多個(gè)方面(圖2)。相信隨著研究的不斷深入，T10及其衍生物調(diào)控的靶分子和生物活性基團(tuán)將會(huì)進(jìn)一步明確，由此將開發(fā)出具有中國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效的神經(jīng)保護(hù)藥物，從而使祖國的傳統(tǒng)中藥走向世界，為人類造福。

圖2 T10及其衍生物神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制Fig.2 Neuroprotective mechanisms of triptolide and its analogues

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