基于ITS2條形碼的中藥材威靈仙與其易混偽品的鑒定

曾旭 李莉 業寧 姚輝 劉志華 秦民堅

2010版《中國藥典》規定威靈仙為毛茛科植物威靈仙ClematischinensisOsbeck，棉團鐵線蓮ClematishexapetalaPall.或東北鐵線蓮ClematismanshuricaRupr.的干燥根及根莖[1]。威靈仙具有祛風濕，通經止痹痛等功效，凡風濕痹痛，麻木不仁，無論上下，皆可應用，是治療風濕痹痛的要藥。作為中國常用中藥由于用藥歷史悠久，分布范圍廣泛，地區用藥習慣差異較大，威靈仙藥材使用混亂現象十分嚴重。北方常見百合科菝葜屬Smilax植物作威靈仙入藥，而南方常見以毛茛科鐵線蓮屬Clematis植物作威靈仙入藥[2,3]。云南部分地區菊科植物顯脈旋復花InulaneruosaWall.的根莖及根作威靈仙入藥。四川地區，金粟蘭科植物草珊瑚Sarandraglabra(Thunb.)NaRai的干燥根莖及全草作銅腳威靈仙入藥[4]。由于缺乏專業的鑒定人員加之市場需求量大致使威靈仙藥材常借不應求，廣東地區曾發生過威靈仙與桃耳七混用的情況，造成數十人中毒的嚴重后果[5]。也曾出現過將毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥須根加工染色來冒充威靈仙使用[6]。由此我們急需一種迅速、簡便有效的方法來鑒別威靈仙藥材與其混偽品，為保證藥材的真實性和指導臨床用藥安全提供科學依據，有必要對威靈仙正品來源與其各地混用品種進行鑒別研究。

DNA條形碼(DNA barcoding)是近年來生物分類和鑒定的研究熱點和方向，該技術是利用基因組中一段公認的標準的、相對較短的DNA片段來對物種進行準確鑒定。通過種間具有足夠的變異、種內特異性而創建的一種新的生物身份識別系統，從而實現對物種的快速自動鑒定[7,8]。自2003年由加拿大分類學家PaulHebert首次選取以線粒體細肥色素C氧化酶亞基(COI)對動物物種進行分析，發現無論在哪個分類水平上該基因都具有良好的識別能力，該技術得到了各國專家的廣泛關注[9,10]。對于植物來說，通用的DNA條形碼序列仍未最終確定世界各地者都稱極投入到植物通用條形碼的研究當中，得到了初敊的可喜成果。陳士林課題組選取真核生物rDNA位于5.8S和26S rRNA之間的一段順反子ITS2序列進行研究，發現ITS2序列不僅可以用于植物的DNA條形碼研究，而且對于動物的DNA條形碼研究也具有重要的意義，在中藥材的物種鑒定方面具有潛在的研究價值[11-18]。本研究即是利用ITS2序列對威靈仙基源植物及其多種混偽品進行DNA條形碼鑒別研究，為該藥材的準確鑒定提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源見表1，包括實驗樣品及來自Genbank下載序列，實驗樣品經中國醫學科學院藥用植物研究所林余霖副研究員進行鑒定，憑證標本保存于中國醫學科學院藥用植物研究所。

表1 材料來源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

商品藥材根使用70%乙醇擦洗表面后研磨，取樣約15 mg；植物葉片采用硅膠進行干燥，取樣約30 mg，利用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序

擴增引物正向為5′-GCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR體系含MgCl22 μl (25 mm)、dNTP 2 μl (2.5 mm)、PCR buffer 2.5 μl(10×)、引物各1.0 μl (2.5 μm)(Sangon Co., China)、聚合酶1.0 U (Biocolor BioScience & Technology Co., China)、總DNA 約1 μl，共為25 μl的反應體積。擴增程序為94 ℃，5分鐘；94 ℃ 30秒，56 ℃ 30秒，72℃ 45秒，40轉；72℃ 10分鐘。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Tiangen Biotech Co., China)回收，純化后作為測序反應的模板，使用ABI 3730XL 測序儀 (Applied Biosystems Co., USA) 進行雙向測序。

1.2.3 數據處理

使用CodonCode Aligner 3.71對測序峰圖進行序列拼接，去除引物區，獲得ITS2 間隔區序列；使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法對網上數據進行分析，去除兩端5.8S和26S區段獲得ITS2間隔區序列。用MEGA 4.0軟件對所有序列分析比對并進行種內、種間遺傳距離的計算。計算基于Kimura 222 Parameter(K2P) 雙參數模型。用NJ鄰接法(neighbour-2-joining method, NJ)利用比對過的序列構建系統發育樹(1000次重復bootstrap檢驗各分支的支持率)，來直觀的鑒定各物種。利用Schultz等建立的ITS2數據庫根據Schultz等[16]建立的ITS2數據庫及其網站預測ITS2二級結構[19]。

2 結果與分析

2.1 序列比較

威靈仙藥材三個基源植物：毛茛科威靈仙Clematischinensis序列長度分別為230 bp，含有三個PolyC和一個PolyG結構，GC含量為69.9%；棉團鐵線蓮Clematishexapetala序列長度分別為220 bp含有三個PolyC和一個PolyG結構，GC含量為69.5%；東北鐵線蓮Clematismanshurica序列長度230 bp，含有三個PolyC和一個PolyG結構，GC含量為69.9%。根據Kimura-2參數遺傳距離模型計算得到的序列間遺傳距離，作為藥典收藏威靈仙藥材的三個基源品種之間的遺傳距離最近，差異最小，威靈仙與棉團鐵線蓮，距離值為0.006；威靈仙與東北鐵線蓮，距離值為0.017。金粟蘭科的草珊瑚與威靈仙，棉團鐵線蓮和東北鐵線蓮之間的遺傳距離最遠，分別為1.083、1.077和1.146。

2.2 種內分析

以棉團鐵線蓮為例來分析種內變異的情況，將實驗所得數據結合從Genbank中下載的兩個ITS2序列作為3個種內參考序列。比對后長度皆230 bp，在151 bp位點的有一個C-G堿基變異位點。此外，有多個缺失位點，分別位于1 bp至5 bp、209 bp、222 bp至230 bp位點。種內平均K2P變異為0.003，種內最大K2P變異為0.005。

2.3 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列種間變異

威靈仙與其主要混偽品ITS2序列間存在較多的變異位點，種間平均K2P距離為0.708。具體種間變異如下圖所示：

(圖1部分，接下頁)

(圖1部分，接上頁)

圖1 威靈仙與其主要混偽品ITS2序列間變異點

2.4 種間聚類分析

本研究發現，ITS2作為DNA條形碼序列，在聚類分類圖上，威靈仙的三個基源植物聚在一起，可以有效的鑒別威靈仙基源植物與其易混偽品。鐵線蓮屬的6種植物聚集為一枝，支持率到達100%，與其他科屬的混偽品，包括草珊瑚、桃兒七、芍藥、毛脈菝葜、土茯苓等植物，都能進行很好的區分，差異非常明顯。而在鐵線蓮屬的6種植物聚集的一枝中，威靈仙藥材正品來源的3種植物聚集為一枝，支持率到達83%，結合枝長方面的信息，非常易于區分威靈仙藥材來源的正品植物和其他同屬的混偽品種。見圖2。

2.5 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列二級結構

如圖3所示，威靈仙與其3個混偽品在二級結構上有明顯差異。重點差異存在于螺旋Ⅳ中。威靈仙二級結構螺旋Ⅳ基部存在2個小莖環中間有1個中頸環，而毛蕊鐵線蓮和柱果鐵線蓮2個物種二級結構螺旋Ⅳ基部的莖環在大小及位置上均與威靈仙存在明顯區別。威靈仙二級結構螺旋I和Ⅲ的莖環在數量、大小及位置與芍藥存在明顯不同。因此，ITS2二級結構也可作為鑒定威靈仙及相近種、偽品的一個方法。

3 討論

傳統的中藥材鑒定方法如形態、顯微結構、超微結構和化學指紋圖譜等鑒定方法，在中藥材鑒定和評價其質量研究中發揮了重要作用。但是，中藥飲片、粉末以及含有生藥原型的傳統中成藥的鑒定非常困難，采用形態鑒定顯然不可取?；瘜W分析方法研究的是植物內的次生代謝產物，而次生代謝產物的含量又受生理條件、采收時間、貯藏等因素的影響，對于化學成分相似的物種就更難以區分因而傳統方法有一定局限性。

ITS2序列長度較短，易于擴增，作為ITS一部分，被廣泛用于系統進化研究[7,8]，也是藥用植物DNA柔形碼鑒定最優的序列之一，物種水平的鑒定成功率高達92.7%。在本研究中，ITS2作為DNA柔形碼序列可以有效的鑒別威靈仙與其混偽品。

結合三種正品威靈仙的產地來看，威靈仙主要生長于廣東、云南、四川、陜西、江蘇、安徽等地，棉團鐵線蓮主要生長于江蘇、山東、陜西、內蒙古、遼寧、吉林、黑龍江等地區，東北鐵線蓮生長于東北三省，以及朝鮮、俄羅斯等地區[20]。綜合地區分別來看，體現出一種由南向北，分別生長威靈仙、棉團鐵線蓮、東北鐵線蓮的特點，再結合系統聚類樹中的枝長信息，在正品威靈仙的單獨枝內部，威靈仙與棉團鐵線蓮聚類為一枝，支持率為64%，且枝長上面，棉團鐵線蓮更長，而東北鐵線蓮的枝長長于棉團鐵線蓮。根據中性理論與“分子鐘”理論，結合以上數據，說明并驗證了威靈仙最先起始于南方，再向北發展的過程中，為適應不同的環境條件，出現了種間的變異，最終形成了多種威靈仙。資料顯示，鐵線蓮屬的分布中心在中國的亞熱帶地區，在中國范圍內云南和四川分布的種類最多(包括變種)，然后以此為中心向四周的分布逐漸減少，Helleboroideae起源中心的推測和鐵線蓮屬古老類群的分布，推測鐵線蓮屬起源于中國西南地區。根據以上分析，本研究結果驗證了這一現象[21]。綜上所述，ITS2作為DNA條形碼序列不僅能夠較好的區別中藥材威靈仙基源植物與其混偽品，同時，對于探討威靈仙屬不同物種間的進化關系亦能起到重要的參考價值。

圖2 基于ITS2序列構建的威靈仙及其混偽品的鄰接(NJ)樹(bootstrap1000次重復，枝上數值僅顯示自展支持率≥50%)

圖3 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列二級結構

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