聯合免疫療法治療小鼠肝癌移植瘤模型的研究①

傅慶國 朱林波 李 曄 應可明 (寧波市第二醫院腫瘤外科,寧波 315010)

隨著腫瘤免疫學的研究進展,腫瘤免疫治療的作用和地位已經逐漸提高,同時,國內外的研究已經證明,腫瘤免疫抑制是制約腫瘤免疫治療效果的一個重要因素[1,2],腫瘤細胞分泌的抑制性細胞因子、腫瘤抗原凋變和免疫逃逸、單一的免疫治療方案等因素影響了免疫治療的效果,對抗腫瘤免疫而言,自然殺傷細胞(Natural Killers,NKs)和細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)具有重要的作用,所以要提高腫瘤免疫治療效果應采用系統的聯合免疫治療方法,包括基礎免疫調節、非特異性免疫治療和特異性免疫治療方法。根據上述原則,所采用的藥物或者技術也分為三類:

第一類為免疫調節劑:以改善調節免疫功能、或促進免疫細胞分化增殖、改善其活性和促進Th1型細胞因子產生的藥物[3],如左旋咪唑、香菇多糖、細胞因子,多種天然免疫調節藥物等,這類藥物一般不引起免疫反應,在本研究中以福建仙芝樓公司提供的靈芝粉為基礎免疫調節藥物,其主要的免疫調節有效成分為靈芝多糖和三萜類。

第二類為非特異性抗腫瘤免疫制劑,能夠引起機體的免疫反應,以活化NK細胞,強化固有免疫為主,當然也有免疫調節作用,本研究中以CpG-A基序為第二類藥物[4,5],CpG-A除具有很強的活化NK細胞的活性,促進抗原遞呈細胞的成熟,增強巨噬細胞的吞噬功能外,也可促進某些Th1型細胞因子的產生,如 IFN-γ,而IFN-γ能促進或上調腫瘤細胞表達MHC分子,這一作用對第三步的特異性免疫治療十分有益。

第三類為特異性抗腫瘤免疫制劑。多數為來源于腫瘤組織或細胞的治療性腫瘤疫苗,活化腫瘤特異性的CTL,引發特異性的抗腫瘤免疫應答。本研究中以自小鼠腫瘤細胞中提取的腫瘤熱休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP70)為第三類藥物[6-8]。HSP70是腫瘤細胞表達的一種重要腫瘤抗原,其在很多人類及動物的腫瘤組織或腫瘤細胞株中表達率很高,腫瘤表達的HSP70可結合多種腫瘤抗原肽,可遞呈多個供T淋巴細胞識別的抗原表位,故有學者稱其扮演了細胞總肽庫的角色,可活化多個克隆的CTL,較單一抗原活化的CTL殺傷更多的腫瘤細胞,同時腫瘤HSP70具有更強的活化DC功能,可有效地完成抗原遞呈;HSP70除主要活化誘導CD8+的T淋巴細胞外,也可活化CD4-、CD8-的T淋巴細胞,γ δ+T 淋巴細胞,其殺傷活性是不受MHCⅠ類分子限制的,還將殺死那些對NK抵抗的腫瘤細胞,所以HSP70作為治療性腫瘤疫苗具有較其它腫瘤抗原明顯的優越性,是一良好的適宜抗原,可完全滿足表達率高、特異性強、多克隆活化等方面的要求,故本研究將以腫瘤HSP70作為特異性的抗腫瘤免疫制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡、雌性清潔級(SPF)C57BL/6j近交系小鼠,體重16～18克,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005,飼養于寧波大學實驗動物中心SPF級實驗室。

閩北地區宗族制度鼎盛。宗族，血緣是維系鄉土村落的重要紐帶，古民居的聚落布局多表現為以宗祠或祖廟為中心聚族而居的形式。這種由血緣派生的建筑空間關系，首先強調的是宗祠的地理位置，或以宗祠，祖廟為中心展開外擴布局，村民們的宗族觀念也很強，因此村落布局的結構便打上了宗族關系的烙印，甚至反映了各姓氏宗族本身的結構。宗祠常位于村落的山脊高點，或是置于道路交通的樞紐位置，或分別以宗祠和支祠為中心形成組團布局，呈現出一種高度向心的空間布局結構。在閩北武夷山，這種以宗祠血緣派生為中心的古民居聚落的布局形式極為普遍，如城村、程村、下梅、黃村、吳屯、宵墩、翁屯、翁墩、五夫等，其他各地也有少量的血緣村落。

字，我一定會簽。你看能不能各退一步，家產一人一半我絕對贊成，離婚不離家我也贊成，但是，我不放心孩子。高考的節骨眼上，我們不能因為自私忽略了這件事對他帶來的影響。你說呢？

1.1.3 靈芝孢子粉劑 由福建仙芝樓生物科技有限公司提供,批準文號:國食健字G20060726,產品批號1011011,密封、陰涼處保存,超純水溶解后使用。

1.2 方法

1.1.5 HSP70-PCs的制備和檢測分析 首先大量擴增小鼠的肝癌細胞,然后低滲裂解,超聲破碎,依次過ConA Sepharose和DEAE層析純化,再經過SDSPAGE和 Western blot檢測,純度達90%以上。常規細菌培養和檢測,無細菌生長。凍干后置于-80℃保存備用。

對特發性炎性腸病患者予以跨理論模型聯合動機性訪談干預能夠有效提高其自我效能感，動機性訪談與跨理論模型干預有效結合，其是以跨理論模型作為框架，并將對患者的健康教育分為意圖轉變時期、行為落實時期，其中，在意圖轉變時期患者已經認識到不良的生活習慣、不遵醫行為會再次誘發加重特發性炎性腸病，但出于進退兩難，此時給予動機性訪談為主，以此挖掘患者的行為改變動機，不斷增強患者的自我管理能力意識，在行為落實時期的主要內容是建立互幫互助小組或成立特發性炎性腸病病友會，以此確保健康教育的實施連續性，對增強患者的自我效能感方面具有積極肯定的價值[14-15]。

1.1.6 主要試劑及儀器

1.1.6.1 主要試劑 ConA Sepharose、DEAE-52均購自瑞典GE Healthcare公司,低分子量蛋白質 Marker 和堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG均購自美國Bio-Science公司,小鼠抗小鼠HSP70單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,小鼠 IFN-γ、CXCL-9及CXCL-10 ELISA試劑盒均購自美國R&D公司。

“他們三個大仙兒，”克里斯蒂娜依次指了指皮特、德魯和莫莉，“實際上，白娘胎里爬出來就整天湊在一起。我特別討厭他們。”

1.1.6.2 主要儀器 超速離心機(日本HIT ACHI公司),SDS-PAGE電泳儀、濕轉儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司),超級多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司),全自動蛋白純化系統AKTA basic PH/C 100(瑞典Amersham公司)。以上儀器均為本實驗室固有財產。

1.1.4 CpG-ODN CpG 基序 序列為 5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′,含有兩個CpG 基序,非甲基化,為抵抗核酸酶的作用,對其兩端堿基進行硫代磷酸化修飾,純化方式為HPLC,由大連寶生物工程有限公司合成,干粉-20℃保存,用無菌PBS溶解稀釋后使用。

1.3 統計學分析 采用SPSS10.0軟件進行統計分析,數據用±s表示。

1.2.2 腫瘤HSP70-PCs分離和純化方法參照文獻[6,7]進行。

由表 2可知，當標準物質在1~5000 ng·L-1的質量濃度范圍內時，采用該檢測方法得到的3種合成麝香的峰面積比與相應的實際濃度比的相關系數都在0.996以上，二者呈現出良好的線性關系，因此可據此相關方程來計算樣品中目標分析物的濃度。HHCB、AHTN和MK的檢出限分別為0.02、0.03 和 0.03 ng·L-1，其回收率分別為(114%±15%)、(107%±11%)和(90%±17%)，由此可知，3種合成麝香的檢出限較低且回收率均較高，實驗結果可信度較高。

1.2.3 實驗動物接種及分組方案 將實驗小鼠第0天右側背部皮下接種上述活腫瘤細胞Hepa 1-6懸液0.1 ml,即4×106/只,第7天均可觸及米粒大小皮下結節,將荷瘤小鼠隨機分成9組,每組10只:生理鹽水對照組1(N1組)、生理鹽水對照組2(N2組)、靈芝孢子粉組(L組)、CpG-ODN治療組(C組)、HSP70-PCs治療組(H組)、靈芝孢子粉+CpG-ODN聯合治療組(L+C組)、靈芝孢子粉+HSP70-PCs聯合治療組(L+H組)、CpG-ODN+HSP70-PCs聯合治療組(C+H組)和靈芝孢子粉+CpG-ODN+HSP70-PCs聯合治療組(L+C+H組)。

1.2.4 給藥方案

村鎮銀行信貸風險內部審計，要精心設計審計制度，抓住審計重點，把握關鍵環節，優化溝通機制，確保機構和人員獨立性，強化人才培養，提升人員專業勝任能力。綜合運用各種設計方法和技巧，提升信貸風險內部審計的質量和效率。

1.2.4.2 L組、L+C組、L+H組及L+C+H組于接種腫瘤細胞的前10天開始灌胃給予靈芝孢子粉劑,按4 g/kg體重劑量給藥,每天灌胃一次,0.2 ml/只,直至實驗組小鼠死亡。

1.1.2 實驗瘤株 由C57BL/6j小鼠正常上皮細胞誘導分化而成肝癌細胞株Hepa 1-6,購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2.4.3 C組、L+C組、C+H組及L+C+H組于實驗小鼠荷瘤第7天,開始瘤旁皮下注射:CpG-ODN 100 μ g/(0.1 ml·只),以后每周兩次,共注射 8次 。

HY-82型油炸鍋：雙缸雙篩電熱炸爐；C21-SDHC15K型電磁爐：浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；ACS-30型電子計價秤：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；BCD-196KDA型冰箱：海爾集團股份有限公司；其他設備：由食品工程學院實驗室提供。

1.2.4.4 H組、L+H組、C+H組及L+C+H組于實驗小鼠荷瘤第10天,開始小鼠左側背部皮下注射HSP70-PCs,10 μ g/(0.1 ml·只),每周一次 ,共免疫 4 次 。

1.2.5 觀察與檢測方法 當N1組荷瘤小鼠死亡一半(5只)時,N2組和CpG組分別取出5只小鼠,摘眼球法采血,吸取上層血清用于細胞因子IFN-γ及趨化性細胞因子CXCL-9、CXCL-10水平的檢測,具體檢測方法參照試劑盒使用說明。其余的作為生存時間及生存率的觀察分析。每3天測量瘤體的最大直徑(a)及橫徑(b)一次,運用公式V=π/6×a×b2來算出瘤體的體積大小。對于死亡的小鼠,先行切下腫瘤稱重,再收集腹水,打開腹腔、胸腔,檢查肝脾肺等器官,如發現肝脾肺等處有轉移灶切下,收集稱重、保存,并記錄好生存時間及上述各項數據。

1.2.1 細胞收集 取對數生長期腫瘤細胞Hepa 1-6,經0.25%胰蛋白酶消化、1 000 r/min,6分鐘離心,棄上清,重復2次,PBS緩沖液重懸細胞,臺盼藍拒染實驗得活細胞比例為96%,調整細胞濃度為4×107ml-1。

2 結果

2.1 腫瘤HSP70-PCs的分離純化與檢測分析 經過2次分離得到的蛋白經SDS-PAGE檢測分子量為70 kD, Western blot分析后證明為腫瘤HSP70。結果見圖1。

圖1 小鼠肝癌細胞Hepa 1-6 HSP70 SDS-PAGE檢測和 Western blot結果Fig.1 SDS-PAGE and Western blot of HSP70 extracted from Hepa 1-6 cells

2.2 肝癌移植瘤模型的建立情況 小鼠肝癌細胞Hepa 1-6按 4×106/只的濃度接種于C57BL/6j小鼠,成瘤率100%,并于接種后第7天可捫及米粒大小的皮下腫瘤結節,未出現腫瘤接種性死亡。

2.3 小鼠皮下肝癌生存曲線 根據每3天測量的皮下瘤體長、短徑,運用公式:V=π/6×a×b2(mm3)得出腫瘤體積,繪出小鼠皮下肝癌移植瘤生存曲線(見圖2)。

1.2.4.1 N1組、N2組于荷瘤第7天開始瘤旁皮下注射:0.9%NaCl 0.1 ml/只。

總而言之，在國慶期間的出口利好過去之后，國內市場重回博弈臺。內需不旺基本算是唯一的利空因素，但已呈常態化的幾項利好因素也難以為高價尿素提供更多的上漲可能。短期內，10月份市場難有大幅波動，在月底或有小幅跌勢，跌幅在50元/噸以內。11月份市場不確定因素較多，大概會迎來一波漲勢。即將召開的磷復肥產銷會，或將成為尿素冬儲大面積啟動的契機。

圖2 各組小鼠的腫瘤在8次治療中的體積變化(mm3)Fig.2 Tumor volume of mice in eight different treated groups(mm3)

表1 各組的腫瘤體積、腫瘤重量、轉移率及生存時間(±s,n=5)Tab.1 Tumor volume,tumor weight and metastasia rate in eight different treated groups(±s,n=5)

表1 各組的腫瘤體積、腫瘤重量、轉移率及生存時間(±s,n=5)Tab.1 Tumor volume,tumor weight and metastasia rate in eight different treated groups(±s,n=5)

Note:L-L+C+H vs Control,P＜0.01.L vs Control,P＜0.05;C-L+C+H vs Control,P＜0.01.L-L+C+H vs Control,P＜0.01.L-L+C+H vs Control,P＜0.01.

Groups Tumor volume(mm3) Tumor weight(g) Metastasia rate(%) Survival rate(%)Control 7 882.4±682.3 5.26±0.42 50 0 L 3 984.4±2 386.6 2.58±1.71 20 20 C 1 896.0±1 723.5 1.46±1.40 0 40 H 1 777.4±1 679.5 1.40±1.32 0 40 L+H 1 141.6±1 049.6 0.80±0.73 0 40 L+C 0 0 0 100 C+H 0 0 0 100 L+C+H 0 0 0 100

圖3 小鼠腫瘤切除標本Fig.3 Tumors excised from miceNote:From left to right:Control group,L group,C group,H group,L+H group,all tumors of L+C group,C+H group and L+C+H group disappeared.

表2 各組小鼠外周血中 IFN-γ、CXCL-9、CXCL-10水平(n=5,pg/ml, ±s)Tab.2 IFN-γ,CXCL-9 and CXCL-10 level in serum of mice of eight different treated groups(n=5,pg/ml,±s)

表2 各組小鼠外周血中 IFN-γ、CXCL-9、CXCL-10水平(n=5,pg/ml, ±s)Tab.2 IFN-γ,CXCL-9 and CXCL-10 level in serum of mice of eight different treated groups(n=5,pg/ml,±s)

Note:L vs Control,P＜0.05;C-L+C+H vs Control,P＜0.01;L vs Control,P＜0.05;C-L+C+H vs Control,P＜0.01;L-L+C+H vs Control,P＜0.01.

Groups IFN-γ CXCL-9 CXCL-10 Control 21.7±2.0 330.7±13.5 317.5±10.5 L 26.9±1.2 461.0±12.9 422.8±24.4 C 38.4±1.9 578.6±11.2 498.4±13.0 H 35.7±1.1 511.4±8.7 505.8±16.4 L+H 42.3±2.2 581.6±14.2 586.0±15.7 L+C 60.0±1.8 608.8±14.1 611.8±14.9 C+H 49.9±1.5 770.2±14.9 690.5±12.5 L+C+H 69.9±3.7 947.4±31.1 828.0±12.5

2.5 各組小鼠外周血中 IFN-γ、CXCL-9及CXCL-10水平(pg/ml,±s) 經治療后,上述幾種細胞因子,均有不同程度的提高,證明這三種免疫制劑對Th1的細胞因子和趨化因子有促升作用,但以聯合應用的最明顯,與對照組相比差異顯著(P＜0.05～P＜0.01,見表2)。

3 討論

腫瘤的發生發展與機體的免疫功能低下有著互為因果的聯系,腫瘤細胞可以分泌多種免疫抑制性的細胞因子,如轉化生長因子β(Transforming Growth Factor β,TGF-β)、白細胞介素 10(Interleukin-10,IL-10)、巨噬細胞(Macrophage,MΦ)和遷移抑制因子(Macrophage Inhibiting Factor,MIF)等多種抑制免疫功能的因子,分布于腫瘤組織的外圍或進入血液循環中,對抗腫瘤免疫功能的抑制是多方面的和多過程參與的,最終將使機體免疫功能向Th2型免疫功能狀態漂移,以利于腫瘤的生長[1,2]。所以腫瘤免疫治療很重要的一環就是要調節患者的抗腫瘤免疫功能,改善免疫抑制。

自由膨脹條件下，水分滲入膨潤土中，最大程度楔開蒙脫石晶格間距，導致吸水后體積發生顯著的膨脹。當干燥失水后，因毛細作用蒙脫石顆粒自身收縮，且團(顆)粒之間也大幅靠近，從而引起顯著的收縮變形。由于納米氧化硅的充填效應和氧化鈣的水化膠凝作用，摻入納米氧化硅和氧化鈣的膨潤土收縮量明顯小于純膨潤土。

試驗設對照組和試驗組共2個處理，每個處理5個重復。試驗日糧配方相同（見表1），對照組所用飼料為錘片粉碎機工藝，試驗組所用飼料為改進后的對輥粉碎機工藝。基礎日糧組成和營養水平見表1。

根據上述分析,對免疫治療應該是免疫調節、非特異性免疫治療與特異性免疫治療并重,同時應用。機體的非特異性抗腫瘤免疫主要由NK承擔;特異性抗腫瘤免疫主要由活化的T淋巴細胞,通常為CTL承擔。CTL通過分子識別機制可以殺滅腫瘤細胞;即MHC限制性;但是有很多腫瘤細胞不表達主要組織相容性復合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)分子(Ⅰ類或Ⅱ類)或異常表達,所以那些不表達MHC分子或表達變異MHC分子的腫瘤細胞CTL無法識別和殺傷,但可由NK細胞殺滅。研究表明,NK細胞缺乏或活性低下時,T細胞數量大幅下降,CTL功能低下,所以NK細胞功能的活化和增強對CTL的功能也有重要的調節作用。所以在腫瘤的免疫治療中,既要強調特異性,又不要忽視非特異的抗腫瘤免疫,針對腫瘤細胞MHC分子的這種表達狀況與NK、CTL的不同功能,同時聯合應用特異性和非特異性的免疫治療可獲得更好的治療效果,就如同化療采用細胞周期特異性和細胞周期非特異性藥物一樣。

在本研究中,我們以靈芝粉為基礎免疫調節藥物,其主要的功效成分為靈芝多糖和三萜類,可以增強T細胞介導的免疫應答,促進淋巴細胞的增殖和轉換,增加Th1型細胞因子的分泌,增強抗原遞呈細胞的功能,恢復和增強整體免疫功能,在抗腫瘤免疫調節中這些成分具有一定的肯定的功效。本研究證明在應用靈芝粉的小鼠組,腫瘤有一定的縮小,IFN-γ和趨化因子9、10均有不同程度的升高。

在本研究中選用CpG-A為第二類制劑,以激活NK細胞。CpG-A除具有很強的活化NK細胞的活性,促進抗原遞呈細胞的成熟,增強巨噬細胞的吞噬功能外,也可促進某些Th1型細胞因子的產生,如IFN-γ,而IFN-γ能促進或上調腫瘤細胞表達MHC分子,這一作用對第三步的特異性免疫治療十分有益。研究證明CpG-A和靈芝粉與CpG-A的聯合應用均可促進IFN-γ、趨化因子9、10的產生,有明顯的免疫調節作用,有利于改善腫瘤微環境,促進抗原遞呈細胞和T細胞的功能。

上述二種免疫調節劑可以改善腫瘤宿主的免疫功能狀態,改善腫瘤周邊微環境,促進IFN-γ的升高,IFN-γ可以促進Th1型細胞因子的產生,抑制Th2型細胞因子的釋放和功能,促進腫瘤細胞表達MHC分子,有利于特異性免疫進一步發揮作用。CpG具有明顯的促升IFN-γ的作用,局部應用CpG有利于改善腫瘤周邊微環境,有利抗腫瘤免疫效應細胞對腫瘤的殺傷,在聯合治療組中發現,應用靈芝和CpG后再應用HSP70治療效果最好,細胞因子的升高也最明顯。對趨化因子CXCL-9、CXCL-10表達三種制劑均有一定的促進作用,三種聯合效果最好。CXCL-9、CXCL-10可以抑制腫瘤新生血管的形成,抑制腫瘤生長,同時腫瘤新生血管減少,生長緩慢還可以減少Th2型細胞因子的產生。進一步減緩腫瘤免疫抑制,有利于Th1型細胞因子和效應細胞發揮抗腫瘤作用[9]。研究證明,這三種免疫制劑的聯合應用是比較理想的腫瘤免疫治療方案,雖然CpG基序對于調節人類的抗腫瘤免疫尚不同于動物實驗[10,11],但是,根據這一原理,可以應用針對活化人類NK細胞的免疫制劑進行臨床應用研究。

在聯合免疫治療組中,有三組小鼠的腫瘤最終消失,但腫瘤的消失速度以三種聯合應用最快,證明本研究的設計符合對腫瘤免疫反應的推測,有必要進行深入的研究。在靈芝粉與CpG的聯合治療組,腫瘤最終也消失,證明靈芝粉可以增強和調節NK細胞的功能,而靈芝粉與HSP70的聯合治療組腫瘤沒有完全消失,CpG與HSP70的聯合免疫治療組腫瘤最終消失,證明NK細胞的功能活化對DC或CTL有重要的輔助作用,這對臨床應用有重要的借鑒意義;所以,這三種免疫治療方法的聯合應用并非簡單地疊加,而是可以互相促進,作用相輔,按步驟應用效果最好,已有研究表明CpG-A及HSP70誘導的抗腫瘤免疫有記憶性效應,維持時間較長,而長期應用免疫調節性中藥可以改善病人的免疫功能,很少有劑量限制性毒性,更有助于維持這種效應,所以更有利于控制腫瘤的復發。

我國的很多傳統扶正類中藥對調節抗腫瘤免疫有較好的作用,應用也十分廣泛,應用免疫學技術和分子生物學技術方法制備NK細胞和CIK以及特異性的DC腫瘤疫苗也已經進入臨床研究,所以本研究對于如何科學地開展腫瘤免疫治療有一定的積極影響。

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