黃心夜合的遺傳多樣性研究

朱秀志，張 華，侯志平

(贛南醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，江西 贛州 341000)

黃心夜合的遺傳多樣性研究

朱秀志，張 華，侯志平

(贛南醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，江西 贛州 341000)

運用隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)，對黃心夜合［Michelia martinii(Levl．)Levl．］自然分布區(qū)的6個自然種群遺傳多樣性進行了研究。從100個隨機引物中篩選出能產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性標記引物18個，共檢測出110個位點，其中多態(tài)性位點為96個，占87.27%;在物種水平上，有效等位基因數(shù)目(Ne)，Nei’s基因多樣性系數(shù)(He)和Shannon表型多樣性指數(shù)(I)分別為1.735 2，0.416 3和0.597 1;總的遺傳變異量(Ht)為0.339 8，其中居群內(nèi)遺傳變異量(Hs)為0.258 7，各居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)達到0.323 1.應用UPGMA法對遺傳距離進行聚類分析并構(gòu)建樹系圖，結(jié)果表明:黃心夜合自然種群具有較高的遺傳多樣性，其種群間的遺傳差異與其地理分布有關(guān)。

黃心夜合;遺傳多樣性;RAPD;DNA

遺傳多樣性是反映種質(zhì)材料遺傳多樣性的有效指標。隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)作為一種簡便、快速、易行的分子標記，是探索生物居群的遺傳結(jié)構(gòu)和研究生物遺傳多樣性及系統(tǒng)進化的重要手段。黃心夜合［Michelia martinii(Levl．)Levl．］，別名夜合花，木蘭科含笑屬喬木樹種。因其材質(zhì)優(yōu)良，多被采伐，故現(xiàn)存數(shù)量稀少。目前，有關(guān)黃心夜合在DNA水平上的遺傳多樣性研究尚未見報道。筆者對黃心夜合不同種群和種群內(nèi)遺傳多樣性做RAPD分析，了解其種群層次上的遺傳多樣性水平，為進一步合理保護、利用與開發(fā)其遺傳資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

材料采自四川省沐川縣涼風坳森林公園、洪雅縣高廟鄉(xiāng)、平武縣寬壩林場、峨眉山觀心坡、雷波縣涼山和重慶市金佛山黃草坪，共6個自然種群。每個種群采集4株～16株個體，植株間隔至少20 m．采集到的新鮮葉片用活性變色硅膠快速干燥，帶回實驗室放于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 植物基因組DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法，將提取液中加入適量聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和β-巰基乙醇，對植物基因組DNA進行提取。提取過程中動作要迅速，盡量減少樣品與空氣的接觸時間。提取后用冷的純酒精沉淀，發(fā)現(xiàn)沉淀物立即用細玻璃棒挑出。晾干后，測定DNA濃度和純度，并通過瓊脂糖電泳檢查DNA的完整性，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選結(jié)果

隨機引物采用上海生工公司引物(OD=2)，共100個引物(S1～S20;S41～S60;S81～S100;S161～S170;S261～S270;S351～S360;S501～S510)，經(jīng)預備試驗選擇重復性強且能產(chǎn)生多態(tài)性、清晰明亮譜帶的18個引物，對所有個體DNA進行擴增。各引物序列及檢測帶數(shù)見表1.

表118個RAPD引物對黃心夜合各居群DNA模板的擴增結(jié)果 個

1.2.3 RAPD擴增反應

根據(jù)Taguchi法優(yōu)化的結(jié)果對幾個主要因子的優(yōu)化比較，確定了PCR的擴增反應在25 uL反應體積中的優(yōu)化反應體系成分為:1.5 mmol/L Mg2+，0.8 mmol/L dNTP，240 nmol/L 隨機引物，80 ng DNA，1.0 U Taq DNA聚合酶(上海生工公司)，1倍的buffer溶液。擴增的熱循環(huán)參數(shù)設(shè)定如下:94℃變性3 min 20 s，1個循環(huán);94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延長2 min，45個循環(huán);72℃延長10 min，1個循環(huán)。設(shè)定儀器自動轉(zhuǎn)入4℃以保存擴增產(chǎn)物等待檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測

取10 uL擴增產(chǎn)物在含有0.5 ug/mL EB(溴化乙錠)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TBE，穩(wěn)壓90 V，電泳0.5 h．電泳結(jié)果在紫外分析儀中觀察、記錄、拍照。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

每一隨機引物重復1次，根據(jù)各標記的遷移率及其有無進行1/0記錄，能重復出現(xiàn)且穩(wěn)定、清晰的RAPD條帶記為1，不出現(xiàn)的條帶記為0，強帶、弱帶的賦值均為1.記錄過程遵循以下原則:只記錄易于辨認的條帶，模糊不清的條帶予以排除;電泳道中無法準確標識的條帶不記錄;遷移率相同但強度不同的條帶，當強帶的強度超過弱帶的1.5倍時，不視為相同的條帶，而是把它們分別計算。最后得到的數(shù)據(jù)輸入POPGENE32軟件進行分析。遺傳距離(D)另按Nei's等的方法計算:

其中:S——任意兩樣本之間的遺傳相似系數(shù);

Nx，Ny——樣本x和樣本y擴增出的DNA片段總數(shù);

Nxy——樣本x和樣本y共有的DNA片段數(shù)。

根據(jù)遺傳距離對各居群進行UPGMA聚類分析，構(gòu)建居群間親緣關(guān)系分支樹系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD產(chǎn)物的多態(tài)性

不同引物擴增出來的帶數(shù)不同，18個引物共擴增出110條帶，長度在300 bp～2 100 bp之間，每個引物產(chǎn)生2條～9條。擴增條帶的多少與含量不成正相關(guān)關(guān)系，平均每個引物約產(chǎn)生6.11條帶。其中96條擴增帶具有多態(tài)性，占PCR擴增帶總數(shù)的87.27%，與黃山花楸、天目木蘭、三棱櫟等相比，比值較高，但與中國蕓芥、樂昌含笑、海南粗榧及珙桐等物種的多樣性條帶百分比值接近。據(jù)此推測，黃心夜合物種水平上的遺傳多樣性背景較為復雜，遺傳變異水平較高。

2.2 遺傳多樣性和居群分化程度

基于18條RAPD引物所擴增出的多態(tài)條帶，利用POPGENE32軟件在假設(shè)遺傳平衡時計算有效等位基因數(shù)(Ne)，Nei’s基因多樣性(He)和Shannon表型指數(shù)(I)等指標見第15頁表2.

表2 黃心夜合遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)

由表2可知，在物種水平上，有效等位基因數(shù)目(Ne)，Nei’s基因多樣性系數(shù)(He)和 Shannon表型多樣性指數(shù)(I)分別為1.735 2，0.416 3和0.597 1，比樂昌含笑高。總的遺傳變異量(Ht)為0.339 8，其中居群內(nèi)遺傳變異量(Hs)為0.258 7，各居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)達到0.323 1，即在總的遺傳變異中有32.31%的變異存在于居群間，各居群已出現(xiàn)較強的遺傳分化。

2.3 居群遺傳距離

群體間RAPD片段共享性(即遺傳相似度)能夠在一定程度上反映群體間DNA的差異。根據(jù)每個引物在6個黃心夜合樣本DNA的擴增結(jié)果，算出6個樣本RAPD片段的平均遺傳相似度。根據(jù)遺傳相似度計算出遺傳距離，見表3.

表3 任意2個居群間的遺傳距離

根據(jù)遺傳距離應用POPGENE32軟件對各居群進行UPGMA聚類分析，構(gòu)建居群間親緣關(guān)系分支樹系圖，見圖1.

由圖1看出，洪雅居群與其它居群的遺傳距離最大，可能與生境被破壞有關(guān)。除洪雅居群，可以把供試的其它5個黃心夜合材料聚為兩大類群:東部的重慶金佛山居群和西部的四川居群，后者包括平武居群、沐川居群、峨眉山居群以及雷波居群。

3 討論

圖1 黃心夜合居群間的遺傳距離聚類分析

筆者首次利用RAPD技術(shù)對黃心夜合種群進行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，黃心夜合具有較高的遺傳多樣性。洪雅高廟鄉(xiāng)黃心夜合居群的RAPD產(chǎn)物條帶數(shù)少，多態(tài)性條帶百分比值小，遺傳多樣性指數(shù)也小，與其它居群遺傳距離較遠，可能與生境被破壞有關(guān)。聚類結(jié)果顯示，東部重慶金佛山居群和西部四川居群被歸為兩類，這一結(jié)果也真實地反映了兩地黃心夜合植株在外觀形態(tài)上的差異，兩類居群之間表現(xiàn)出較大的遺傳差異與它們的地理距離相關(guān)，即較遠的金佛山居群與其它地方的居群遺傳距離較大。

遺傳多樣性是反映種質(zhì)材料遺傳多樣性的有效指標。黃心夜合目前尚未瀕危，其遺傳多樣性指數(shù)較高，遺傳差異較大，在品種改良中有較大的遺傳潛力。有效保護并維持黃心夜合的遺傳多樣性，有助于其適應環(huán)境變化。而且保護黃心夜合的基因資源，也是遺傳改良工作的基礎(chǔ)。

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Study on Genetic Diversity of Michelia martini

Zhu Xiuzhi，Zhang Hua，Hou Zhiping
(Basic Medical College，Gannan Medical University，341000 Ganzhou，China)

The genetic variations of six natural populations of Michelia martini from different distribution regions were investigated at the DNA level by employing RAPD．Out of 100 random primers，eighteen random primers were screened，which could generate highly reproducible and clear RAPD fragments for further population analysis ．With these primers，a total of 110 discernible DNA fragments were obtained and of which 96(87.27%)were polymorphic，At species level，the effective number of allele(Ne)was 1.735 2．Nei's gene diversity(He)was 0.416 3 and Shannon index(I)was 0.597 1．Total genetic diversity(Ht)was 0.339 8，and the genetic diversity within populations(Hs)was 0.258 7．The coefficient of gene differentiation(Gst)among populations was 0.323 1．UPGMA map were made according to the genetic similarity and distance of the six populations calculated in this article．The result showed that M．martini had a high genetic diversity．The genetic diversity of M．martini among the six natural populations is primarily related to their geographic distribution．

Michelia martini;genetic diversity;RAPD;DNA

S792.99

A

1007-726X(2011)04-0013-04

2011-09-21

朱秀志(1973— )，男，安徽玉河人，2006年畢業(yè)于西華師范大學，講師。